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Epithelia form protective barriers and regulate molecule transport between the mesenchyme and environment. Amongst all metazoans, only sponges are said to lack 'true' epithelia however the physiology of sponge cell layers are rarely studied empirically. Aggregates and gemmules of a freshwater demosponge, Spongilla lacustris, were used to grow confluent tissue over permeable culture wells which are required for transepithelial recordings. The transepithelial potential (TEP) of S. lacustris was slightly negative (-3mV), indicating possible control of ion transport. Transepithelial resistance (TER) was recorded between 1-2 k cm2, the same order of magnitude as many vertebrate epithelia. Cultures with high resistance blocked the passage of the small tracer molecules 14C-PEG, 3H-Inulin and ruthenium red. Pinacocytes were spatially stable over time and epithelial layers were morphologically similar in freshwater and marine species. These results suggest that sponge cell layers are able to control solute and ion transport, the physiological attributes of functional epithelia. / Physiology, Cell and Development Biology

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / As mass production of carbon nanoparticles (CNPs) continues to rise, the likelihood of occupational and environmental exposure raises the potential for exposure‐related health hazards. Although many groups have studied the effects of CNPs on biological systems, very few studies have examined the effects of exposure of cells, tissues or organisms to low, physiologically relevant concentrations of CNPs. Three of the most common types of CNPs are single wall nanotubes (SWNT), multi wall nanotubes (MWNT) and fullerenes (C60). We used electrophysiological techniques to test the effects of CNP exposure (40 μg/cm2 – 4 ng/cm2) on barrier function and hormonal responses of well characterized cell lines representing barrier epithelia from the kidney (mpkCCDcl4) and airways (Calu‐3). mpkCCDcl4 is a cell line representing principal cell type that lines the distal nephron in an electrically tight epithelia that aids in salt and water homeostasis and Calu‐3 is one of the few cell lines that produces features of a differentiated, functional human airway epithelium in vivo. These cell lines respond to hormones that regulate salt/water reabsorption (mpkCCDcl4) and chloride secretion (Calu‐3). In mpkCCDcl4 cells, after 48 hour exposure, the transepithelial electrical resistance (TEER) was unaffected by high concentrations (40 – 0.4 μg/cm2) of C60 or SWNT while lower, more relevant levels (< 0.04 μg/cm2) caused a decrease in TEER. MWNT decreased TEER at both high and low concentrations. CNT exposure for 48 hour did not change the transepithelial ion transport in response to anti‐diuretic hormone (ADH). In Calu‐3 cells, after 48 h of exposure to CNPs, fullerenes did not show any effect on TEER whereas the nanotubes significantly decreased TEER over a range of concentrations (4 μg/cm2‐0.004 ng/cm2). The ion transport response to epinephrine was also significantly decreased by the nanotubes but not by fullerenes. To look at the effect of exposure times, airway cells were exposed to same concentrations of CNPs for 24 and 1h. While the 48 h and 24 h exposures exhibited similar effects, there was no effect seen after 1h in terms of TEER or hormonal responses. In both the cell lines the magnitude of the transepithelial resistance change does not indicate a decrease in cellular viability but would be most consistent with more subtle changes (e.g., modifications of the cytoskeleton or changes in the composition of the cellular membrane). These changes in both the cell lines manifested as an inverse relationship with CNP concentration, were further corroborated by an inverse correlation between dose and changes in protein expression as indicated by proteomic analysis. These results indicate a functional impact of CNPs on epithelial cells at concentrations lower than have been previously studied and suggest caution with regard to increasing CNP levels due to increasing environmental pollution.

La toxine thermostable d’E.coli (STb) est une cause de diarrhée chez l’homme et l’animal. STb se lie au sulfatide, son récepteur, puis s’internalise. Dans le cytoplasme, par une cascade d’événements, STb déclenche l’ouverture des canaux ioniques permettant la sécrétion des ions et la perte d’eau menant à la diarrhée. Les jonctions serrées forment une barrière physique intercellulaire dans les cellules épithéliales intestinales, contrôlant ainsi le flux paracellulaire des ions et de l’eau. Les jonctions serrées sont affectées par divers pathogènes et par leurs toxines. À ce jour, l’effet de STb sur les jonctions serrées n’a pas été étudié. L’étude entreprise visait à explorer l’effet de STb sur les jonctions serrées et la barrière épithéliale des cellules intestinales. Des cellules épithéliales intestinales du colon humain (T84) ont été traitées pendant 24h soit avec la toxine STb purifiée soit avec une souche d’E.coli exprimant STb. La résistance transépithéliale (TER), le flux de marqueurs paracellulaires et la microscopie confocale ont été utilisés pour analyser les effets de STb sur les jonctions serrées. Les monocouches traitées par la souche E.coli exprimant STb et la toxine STb purifiée ont manifesté une forte réduction de TER (p<0.0001) parallèlement à une augmentation significative de la perméabilité paracellulaire à l’Albumine de Sérum Bovin marqué avec l’IsoThioCyanate Fluoroscéine, BSA-FITC (p<0.0001) comparativement aux cellules non traitées et aux cellules traitées par une souche d’E.coli commensale non-toxinogène. L’augmentation de la perméabilité paracellulaire induite par STb a été associée à une dissolution générale et une condensation des fibres de stress centrales des filaments d’actine. Le réarrangement des filaments d’actine a été accompagné par une redistribution et une fragmentation des protéines des jonctions serrées dont l’occludine, la claudine-1 et la Zonula Occludens-1. Les mêmes modifications on été observées après l’intoxication des cellules T84 avec un octapeptide synthétique retrouvé dans la séquence de STb correspondant à une séquence consensus de la toxine ZOT de Vibrio cholerae, impliquée dans la réorganisation des jonctions serrées. Cet effet n’a pas été observé lorsque les cellules ont été traitées avec un octapeptide synthétique comportant les mêmes acides aminés mais distribués de façon aléatoire ou avec la toxine mutée (D30V). Nos résultats montrent pour la première fois que STb induit le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale en modifiant la distribution des protéines des jonctions serrées. Ces résultats ouvrent une nouvelle voie pour la compréhension de la pathogenèse de diarrhée causée par la toxine STb. / Escherichia coli heat-stable toxin (STb) causes diarrhea in Man and animals. STb binds to sulfatide, its receptor, followed by its internalization. Inside the cytoplasm, through a cascade of events, STb triggers the opening of ion channels allowing ion secretion and water loss leading to diarrhea. Tight junctions (TJs) are well known for controlling paracellular traffic of ions and water by forming a physical intercellular barrier in epithelial cells. Some bacterial toxinz are known to affect adversibly TJs. To date, the impact of STb on TJs has not been investigated. The present study aimed to explore the effect of STb on TJs and the barrier function in intestinal epithelial cells. Human colon intestinal epithelial cells (T84) were treated for 24h with either purified STb toxin or an E. coli strains expressing STb. TransEpithelial Resistance (TER), paracellular flux marker and confocal microscopy were used to analyze the effect of STb toxin on TJs. An E. coli strains expressing STb as well as purified STb caused a significant reduction of TER (p<0.0001) parallely to an increase in paracellular permeability to BSA-FITC (p<0.0001) compared to untreated cells or a commensal non toxinogenic E.coli strain. The increased paracellular permeability induced by STb was associated with a marked general dissolution and condensation of central F-actin stress fibers. F-actin disorganisation was accompanied by redistribution and fragmentation of occludin, claudin-1 and ZO-1 (Zonula Occludens-1) proteins. These changes were also observed following intoxication of T84 cells with an 8 amino acids peptide found in the STb sequence corresponding to a consensus sequence of Vibrio cholerae Zot toxin, shown to be involved in TJs disassembly. This effect was not observed with the scramble peptide and D30V mutant. Our findings suggest that STb induces epithelial barrier dysfunction by changes in tight junction proteins that could contribute to the observed diarrhea. These results provide new insight into the diarrhea pathogenesis caused by STb.

La toxine thermostable d’E.coli (STb) est une cause de diarrhée chez l’homme et l’animal. STb se lie au sulfatide, son récepteur, puis s’internalise. Dans le cytoplasme, par une cascade d’événements, STb déclenche l’ouverture des canaux ioniques permettant la sécrétion des ions et la perte d’eau menant à la diarrhée. Les jonctions serrées forment une barrière physique intercellulaire dans les cellules épithéliales intestinales, contrôlant ainsi le flux paracellulaire des ions et de l’eau. Les jonctions serrées sont affectées par divers pathogènes et par leurs toxines. À ce jour, l’effet de STb sur les jonctions serrées n’a pas été étudié. L’étude entreprise visait à explorer l’effet de STb sur les jonctions serrées et la barrière épithéliale des cellules intestinales. Des cellules épithéliales intestinales du colon humain (T84) ont été traitées pendant 24h soit avec la toxine STb purifiée soit avec une souche d’E.coli exprimant STb. La résistance transépithéliale (TER), le flux de marqueurs paracellulaires et la microscopie confocale ont été utilisés pour analyser les effets de STb sur les jonctions serrées. Les monocouches traitées par la souche E.coli exprimant STb et la toxine STb purifiée ont manifesté une forte réduction de TER (p<0.0001) parallèlement à une augmentation significative de la perméabilité paracellulaire à l’Albumine de Sérum Bovin marqué avec l’IsoThioCyanate Fluoroscéine, BSA-FITC (p<0.0001) comparativement aux cellules non traitées et aux cellules traitées par une souche d’E.coli commensale non-toxinogène. L’augmentation de la perméabilité paracellulaire induite par STb a été associée à une dissolution générale et une condensation des fibres de stress centrales des filaments d’actine. Le réarrangement des filaments d’actine a été accompagné par une redistribution et une fragmentation des protéines des jonctions serrées dont l’occludine, la claudine-1 et la Zonula Occludens-1. Les mêmes modifications on été observées après l’intoxication des cellules T84 avec un octapeptide synthétique retrouvé dans la séquence de STb correspondant à une séquence consensus de la toxine ZOT de Vibrio cholerae, impliquée dans la réorganisation des jonctions serrées. Cet effet n’a pas été observé lorsque les cellules ont été traitées avec un octapeptide synthétique comportant les mêmes acides aminés mais distribués de façon aléatoire ou avec la toxine mutée (D30V). Nos résultats montrent pour la première fois que STb induit le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale en modifiant la distribution des protéines des jonctions serrées. Ces résultats ouvrent une nouvelle voie pour la compréhension de la pathogenèse de diarrhée causée par la toxine STb. / Escherichia coli heat-stable toxin (STb) causes diarrhea in Man and animals. STb binds to sulfatide, its receptor, followed by its internalization. Inside the cytoplasm, through a cascade of events, STb triggers the opening of ion channels allowing ion secretion and water loss leading to diarrhea. Tight junctions (TJs) are well known for controlling paracellular traffic of ions and water by forming a physical intercellular barrier in epithelial cells. Some bacterial toxinz are known to affect adversibly TJs. To date, the impact of STb on TJs has not been investigated. The present study aimed to explore the effect of STb on TJs and the barrier function in intestinal epithelial cells. Human colon intestinal epithelial cells (T84) were treated for 24h with either purified STb toxin or an E. coli strains expressing STb. TransEpithelial Resistance (TER), paracellular flux marker and confocal microscopy were used to analyze the effect of STb toxin on TJs. An E. coli strains expressing STb as well as purified STb caused a significant reduction of TER (p<0.0001) parallely to an increase in paracellular permeability to BSA-FITC (p<0.0001) compared to untreated cells or a commensal non toxinogenic E.coli strain. The increased paracellular permeability induced by STb was associated with a marked general dissolution and condensation of central F-actin stress fibers. F-actin disorganisation was accompanied by redistribution and fragmentation of occludin, claudin-1 and ZO-1 (Zonula Occludens-1) proteins. These changes were also observed following intoxication of T84 cells with an 8 amino acids peptide found in the STb sequence corresponding to a consensus sequence of Vibrio cholerae Zot toxin, shown to be involved in TJs disassembly. This effect was not observed with the scramble peptide and D30V mutant. Our findings suggest that STb induces epithelial barrier dysfunction by changes in tight junction proteins that could contribute to the observed diarrhea. These results provide new insight into the diarrhea pathogenesis caused by STb.

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