Regensburg, Universiẗat, Diss., 2009.

Zsfassung in engl. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2008

Universiẗat, Diss., 2005--Würzburg.

Metagenome and metatranscriptome (Meta'ome) sequencing is used to study complex microbial communities. There are already methods that perform well for taxonomic assignment of metagenomic data, but for quantification of metatranscriptomic data, these methods only assign a small percentage of reads with their pre-compiled databases. In contrast to RNA-seq of a single species, in meta’omics studies, reads are assigned to multiple reference sequences due to microbial sequence similarity (ambiguous mapping). Alignment-free methods established for bulk RNA-seq data may be useful for resolving read ambiguity and quantifying meta'omic data. So far, the usage of alignment-free methods in meta’omics has focused on taxonomic abundances but does not provide quantifications of genes or gene families for functional characterization of the meta'ome. Salmon's lightweight alignment, an alignment-free method, quantifies gene abundances precisely despite including reads with mapping uncertainties such as sequencing errors and high-similarity sequences, making it a superior tool for quantifying meta'omic data that uses species' gene sequences as references. This work presents the application of lightweight alignment methods like Salmon to efficiently quantify meta’omic data. I begin by evaluating the existing pipelines/tools with unpublished metagenome and metatranscriptome datasets gathered to examine how the microbiome protects against Salmonella Typhimurium infection in a mouse typhoid model. This analysis revealed a lack of representation of microbiome-associated reference sequences in the pre-compiled databases of the available tools, as well as the difficulty to assign ambiguous mapping to one species in the presence of closely related reference sequences. As an initial proof of concept, Salmon's lightweight alignment assigned the majority of the reads to bacterial reference genomes combined with mouse metagenomic-assembled genomes (MAGs), resolving mapping ambiguity. I performed a simulation-based benchmark analysis using Salmon employing different reference sequence databases to examine the influencethe reference database. For an efficient and reproducible analysis, I developed FLAMe (Flexible Lightweight Alignment of Meta'ome), a Nextflow pipeline that uses Salmon's lightweight and selective alignment to quantify meta'omics data at the species gene level. I examined the influence of gut inflammation and subsequent Salmonella Typhimurium colonisation on the resident mouse gut microbiota using the FLAMe pipeline. This way, I was able to recover many taxonomic and functional groups which have previously been related to Salmonella pathogenesis in the gut. Taken together, this demonstrates that the pipeline quantifies meta'omic data efficiently and reliably. Lastly, I showed that FLAMe can be applied to different experimental setups that generate meta'omic data, which shows its versability in characterising the microbiome. / Metagenomische und metatranskriptomische (Meta'ome) Sequenzierung ermöglicht die Untersuchung einer mikrobiellen Gemeinschaft in ihrer natürlichen Umgebung. Methoden für die taxonomische Bestimmung von metagenomischen Daten existieren, ordnen jedoch aufgrund ihrer begrenzten Datenbanken nur einen geringen Prozentsatz der metatranskriptomischen Reads zu.. Im Kontrast zur RNA-Sequenzierung einer einzelnen Spezies (RNA-seq) werden die Reads mehreren Referenzgenomen zugeordnet. Alignment-freie Methoden, die für RNA-seq bereits etabliert sind, können helfen die Zuweisung und Quantifizierung von Reads aus Meta'ome-Daten zu verbessern. In Meta’ome Studien wurden Alignment-freie Methoden bisher überwiegend zur Bestimmung der taxonomischen Zusammensetzung verwendet. Sie sind daher nicht geeignet, um die Expression von Genen oder Gen-Familien zu bestimmen, was für eine funktionelle Charakterisierung notwendig ist. Salmons “quasi-mapping”, ein Alignment-freier Ansatz, quantifiziert Genexpression mit hoher Genauigkeit, obwohl es Reads mit Sequenzierungsfehlern oder sehr ähnlichen Sequenzen mit einbezieht. Deswegen sollte es sich ebenfalls gut zur Meta'ome Quantifizierung eignen. Diese Arbeit zeigt die Anwendung von Alignment-freien Methoden wie Salmon auf Meta'ome-Daten. Zuerst evaluierte ich vorhandene Pipelines / Tools mit unseren eigenen metagenomischen und metatranskriptomischen Datensätze eines Maus-Typhus-Modells um zu untersuchen, wie das Mikrobiom vor einer Salmonella Typhimurium Infektion schützt. Dabei zeigte sich, dass viele mikrobiom-assoziierte Referenzgenome in den vorkompilierten Datenbanken der vorhandenen Tools fehlten. Zusätzlich bestehen Ambiguitäten bei der Zuordnung von Reads zu Referenzgenomen eng verwandter Spezien. Mit Salmon war es jedoch möglich, die Mehrheit der Reads einer Kombination des RefSeq Referenzgenoms und eines zusammengebauten Maus-Metagenom Referenzgenoms (MAG) zuzuordnen. Mit Hilfe von Simulationen untersuchte ich den Effekt von unterschiedlichen Referenz-Datenbanken auf die Quantifizierung mit Salmon. Für eine effiziente und reproduzierbare Analyse entwickelte ich FLAMe (Flexible Lightweight Alignment of Meta'ome), eine Nextflow Pipeline, die mit Salmons leichtem und selektivem Alignment von Meta'ome-Daten auf dem Level von Genen einzelner Spezies quantifiziert. Damit untersuchte ich den Einfluss von Darmentzündungen und anschließender Kolonisierung durch Salmonella Typhimurium auf das residente Maus-Mikrobiom. Dabei identifizierte ich zahlreiche taxonomische und funktionelle Gruppen, die bereits in früheren Studien mit der Pathogenese von Salmonella im Darm in Verbindung gebracht wurden. Insgesamt zeigte meine Analyse, dass die FLAMe Pipeline das Meta’ome effizient und zuverlässig quantifiziert. Zusätzlich wandte ich FLAMe auf weitere Meta'ome Experimente an. Dies zeigte, dass die Pipeline flexibel und vielseitig anwendbar ist

Erfassung und Bewertung der Immunzell-Dynamik ausgehend vom Transkriptom der Milz, Dissertation zum Vergleich von DCQ-Vorhersagen einzelner Immunzellpopulationen während akuter und chronischer LCMV-Infektionen mit experimentellen Daten. / The outcome of viral infections is determined by a complex interaction between the spreading virus and the host's immune response. In order to understand this interaction in detail, acute and chronic infections were generated in previous experiments in the mouse model with the lymphocytic choriomeningitis virus and the transcriptomes of the entire spleen were determined in chronological order. This experimental approach results in the loss of information about the cells that produce the identified transcripts. This cell information can be recovered using special analysis programmes such as DCQ. However, it must then be confirmed using experimental methods. The aim of my work was to experimentally validate the prediction of individual immune cell populations. To this end, spleens were removed from LCMV-infected mice, the spleen cells were isolated and characterised by means of specific surface proteins using flow cytometry. I was thus able to partially validate the DCQ predictions of different immune cells and immune cell subtypes such as CD8+ T cells, CD103+ DCs, neutrophils, regulatory CD4+/ FOXP3+ T cells, NK cells and monocytes. These results made it possible to correlate the dynamics of the different cell types with immunological processes. The results were included in a previously published paper (Pedragosa et al., 2019).

Staphylococcus aureus ist ein bedeutender opportunistischer Krankheitserreger, der eine Vielzahl von Infektionen in Menschen und Tieren hervorrufen kann. Das Krankheitsbild reicht von leichten Hautinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Endokarditis, Sepsis oder Pneumonien. S. aureus ist ein Haupterreger nosokomialer Infektionen. Besonders die Antibiotikaresistenzentwicklung von S. aureus–Stämmen ist problematisch. Als wirksame Antibiotika können zur Zeit oft nur noch Vancomycin, Synercid oder Linezolid zur Therapie eingesetzt werden. Die alarmierende Resistenzentwicklung in S. aureus verdeutlicht, dass die Entwicklung neuer Antibiotika und die Identifizierung neuer bakterieller Angriffsstrukturen dringend erforderlich ist. Gängige antiinfektive Therapeutika sind gegen die bakterielle Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel oder die Proteinbiosynthese gerichtet. In dieser Arbeit sollten Virulenz-relevante Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika untersucht werden. Insgesamt wurden sieben Gene analysiert, von denen vier zu Anfang dieser Arbeit in S. aureus noch nicht charakterisiert waren. Die Zielgene (clpP, purH, ssrA und smpB) in S. aureus sollten deletiert werden, um ihre Überlebensnotwendigkeit in vitro- und in vivo zu überprüfen. Eine Deletion gelang bei den Genen clpP und purH, die somit als nicht essenziell in S. aureus zu betrachten sind. Die bereits zuvor als nicht-essenziell charakterisierten Gene arlR, arlS und putP wurden deletiert und die Mutanten dclpP, darlR, darlS, dpurH und dputP wurden phänotypisch in Hinsicht auf ihren Einfluss auf die Pathogenität in S. aureus analysiert. Die differenzielle Genexpression der Mutanten dclpP und darlR wurde mit Hilfe von Microarray-Hybridisierungsexperimenten untersucht. Die ∆clpP-Mutante zeigte einen starken Wachstumsdefekt bei verschiedenen Temperaturen (30, 37, 42°C) und war nicht mehr in der Lage bei 20°C zu wachsen. Ebenso war das Wachstum unter anaeroben Bedingungen stark beeinträchtigt. Der Stamm dclpP wies eine verringerte hämolytische Aktivität sowie eine verminderte Adhärenz an Polystyren auf. Außerdem konnte eine stark erhöhte autolytische Aktivität in einem Triton X-100-Assay beobachtet werden. In einem Invasions-Zellkulturassay mit 293T-Epithelzellen konnte eine ~10-fach erhöhte Invasivität im Vergleich zu dem isogenen Wildtyp festgestellt werden. Die Komplementierung der ∆clpP-Mutante durch Einführung eines clpP-Expressionsvektors führte nahezu bei allen getesteten Bedingungen zur Wiederherstellung des wildtypischen Phänotyps. Die Transkriptomanalyse der dclpP-Mutante ergab eine deutliche Veränderung in der Genexpression (15 % aller Gene). Eine computerunterstützte Analyse der Upstreambereiche der deregulierten Gene führte zu der Identifizierung verschiedener Regulons, die bei der bakteriellen Antwort auf verschiedene Stressbedingungen eine Rolle spielen. Die clpP-Deletion betrifft besonders Regulatoren, deren Aktivität in Abhängigkeit zu veränderten Redox-Bedingungen reguliert wird, wie z. B. verschiedenen Stressbedingungen und Anaerobiose. Die Konstruktion der darlR- und darlS-Mutanten führte zu einer gesteigerten hämolytischen Aktivität, einer erhöhten Adhärenz an Polystyren sowie einer erhöhten autolytischen Aktivität in Triton X-100-Assays. Die Internalisierungsrate durch 293T-Epithelzellen war vermindert. Die darlR-Mutante wurde in einem Katheter-assoziierten Infektionsmodell in Ratten eingesetzt. Die kompetitive Infektion mit Mutante und Wildtyp ergab einen deutlichen Nachteil bei der Etablierung einer Infektion durch die Mutante. Die Transkriptomanalyse der 8325darlR-Mutante in der exponenziellen und in der stationären Phase unterstreicht den großen Einfluss des ArlRS-Zwei-Komponenten-Systems auf die Regulation der Genexpression in S. aureus. In der exponenziellen Phase wurden insgesamt 5 % und in der stationären Phase 15 % der Gene differenziell exprimiert. dpurH- und dputP-Mutanten wiesen in vitro keine Veränderungen im Wachstums-verhalten, der Biofilmbildung oder hämolytischen Aktivität auf. In einem Infektionsmodell in Ratten führte die Deletion von purH in dem S. aureus-Stamm MA12 zu einer signifikanten Verminderung der Virulenz. Die Herstellung von smpB- und ssrA-Deletionsmutanten verlief ohne Erfolg. Es wurde versucht, einen direkten Nachweis für den essenziellen Charakter dieser Gene durch den Einsatz konditional letaler Expressionssysteme zu erbringen. Weder der Austausch des wildtypischen durch einen regulierbaren Promotor noch eine Antisense-RNA-Strategie war für eine eindeutige Klärung dieser Frage ausreichend. Es konnte durch diese Arbeit jedoch gezeigt werden, dass die Antisense-RNA-Strategie eine Beeinträchtigung des Wachstums von S. aureus bewirkt. / Staphylococcus aureus is an important opportunistic pathogen that can cause a wide range of diseases in humans and animals. The outcome of an infection can range from mild skin infections to life-threatening infections, like endocarditis, bacteraemia and pneumonia. Currently, methicillin-resistant S. aureus strains (MRSA) that have acquired numerous additional resistances towards several antibiotics have established in the hospital-setting. Therefore, the treatment of hospital-acquired infections with S. aureus in a rising number of patients is becoming increasingly complicated. The remaining effective antibiotics to treat infections with multi-resistant MRSA are vancomycin, synercid, and linezolid. However, MRSA isolates with intermediate and high resistance towards vancomycin have been described recently, as well as synercid- and linezolid-resistant strains. The emergence and spreading of multi-resistant S. aureus is alarming and emphasises the need to develop new antibiotics. Currently, well-established therapeutics targeting processes of cell wall biosynthesis, DNA and RNA metabolism, and protein biosynthesis. This study comprises the investigation of putative targets of novel antibiotics. Therefore, seven target genes were selected and functionally characterised in vitro and in vivo. Four of these genes have not been characterised in S. aureus at the beginnig of this study. A deletion mutagenesis approach for these genes (clpP, purH, ssrA and smpB) should provide an indication of their essientiallity for the organism. clpP and purH could be successfully inactivated, supporting their non-essential role in S. aureus. The non-essential genes arlR, arlS and putP were inactivated and different phenotypic studies of the S. aureus deletion mutants ∆clpP, ∆arlR, ∆arlS, ∆purH and ∆putP were performed. Whole genome microarray analysis was applied on ∆clpP and ∆arlR mutants to study the manifold transcriptional changes by the inactivation of these two regulators in S. aureus. The growth rate of ∆clpP was strongly reduced at different temperatures (30°C, 37°C, 42°C) and completely inhibited at 20°C. Growth was highly impaired under anaerobic conditions. Moreover, ClpP deficiency resulted in a reduced hemolytic activity and diminished adherence to polystyren as well as a strongly enhanced autolytic activity. The invasiveness of ∆clpP was significantly elevated (~10-fold) compared to the isogenic wildtype as shown in an invasion assay with the 293T epithelial cell line. All these effects could be successfully reverted by complementation of the mutant strain with a vector expressing the native clpP sequence. The microarray analysis of ∆clpP revaeled a strong shift of the bacterial transcriptome (15 % of all genes were differentially regulated). Especially regulators and genes which reply to varying redox conditions, for example as a result of different stresses or anaerobiosis, were shown to be affected at the transcriptional level. Deletion mutants of the virulence-associated two component system genes arlR and arlS caused a higher hemolytical activity, enhanced adherence to polystyrene and an enhanced autolytic activity in a Triton X-100 assay. Furthermore, internalisation of arlRS bacteria by 293T epithelial cells was diminished, and ∆arlR was significantly less infectious than the wildtype in a catheter-related infection model in rats. The microarray analysis of ∆arlR in the exponential and stationary growth phase revealed a strong influence of the ArlRS-system on gene expression in S. aureus. In the exponential phase a total of 5 %, and in the stationary phase 15 % of all genes were differentially regulated. ∆purH and ∆putP showed no alterations of growth, biofilm formation or hemolytic properties compared to the wild type strain. Inactivation of purH, however, caused a significant attenuation of S. aureus MA12 in a rat-infection model. Since the construction of ssrA and smpB deletion mutants have failed, conditional lethal expression systems should be utilised to address the question of essentiality of these genes. It could be shown by this study that neither the genetic exchange of the wildtype promoter with an in vitro adjustable promoter nor an antisense RNA-based approach were sufficient to clearify the status of ssrA and smpB as essential genes in S. aureus. Importantly, the expression of antisense RNAs for both genes resulted in a growth defect of S. aureus

The obligate intracellular gram-negative bacterium, Chlamydophila pneumoniae (Cpn), has a significant impact as an acute and chronic disease-causing pathogen. Its potential to undergo persistent infections has been linked to chronic diseases. Several in vitro cell culture models are used to study persistent conditions, mainly IFN_ stimulation, treatment with antibiotics and iron depletion. Little is known about changes in the Cpn transcriptome during the acute and persistent infection. Therefore, the Cpn transcriptome during its acute developmental cycle and iron depletion-mediated persistence was examined in this study. Based on expression profiles, genes with similar expression changes formed 12 clusters using the self-organizing map algorithm. While other studies define genes based on their onset of transcription, here the important feature for clustering was the expression profile. This turned out to be more appropriate for comparing the time specific relevance of a certain cluster of genes to their proposed functions in the cycle. The Cpn clusters were grouped into the 'Early', 'Mid' and 'Late' classes as described for Ctr. Additionally, a new gene expression class containing genes with steadily increasing expression at the end of the developmental cycle was defined and termed 'Tardy' class. Comparison of the Cpn clusters to published proteomics data showed that genes encoding elementary body (EB) proteins peaked in the 'Late' gene cluster. This indicated that genes of the ‘Late’ and ‘Tardy’ class have different roles in RB to EB re-differentiation. Moreover, using lexical comparison the EB mRNA profile was significantly linked to the ‘Tardy’ cluster class. This provided evidence that initial translation in the cycle might be directed from stable transcripts present in the infectious EB form. Based on these criteria the novel ‘Tardy’ class was separated from the ‘Late’ class. The gene ontologies were used to identify specific pathways and physiological functions active during the different phases of development. Additionally, the transcriptome of Cpn in the persistent stage was compared to that of the acute developmental cycle. The Cpn transcriptome was altered in the iron-depletion mediated persistence. Genes upregulated were linked to clusters at the beginning of the developmental cycle, and genes down-regulated were linked to clusters at the end of the developmental cycle. These data provided strong evidence that the Cpn transcriptome during persistence is a gene expression arrest in mid-development. In early acute infection convergently or divergently oriented gene pairs preferentially had an antagonistic expression profile, whereas tandemly oriented gene pairs showed a correlated expression profile. This suggests that the Cpn genome is organized mainly in tandemly arranged operons and in convergently or divergently oriented genes with favored antagonistic profiles. The microarray studies done with the Cpn strain CWL029 also showed expression signals for several genes annotated only for the Cpn strains AR39 and J138. BLAST comparison verified that these genes are also coded in the CWL029 genome. Several of these genes were convergently arranged with their neighboring gene and shared overlapping genome information. Among these were parB, involved in DNA segregation and rpsD, an alternative sigma factor responsible for the transcription at late stages of the developmental cycle. Both genes have been described to have major roles in the chlamydial cycle. These genes had an antagonistic expression profile at the beginning of the acute developmental cycle and in persistence, as described before to be predominant for convergently oriented genes. Real time RT-PCR analysis showed that full-length rpsD mRNA transcripts were down-regulated, whereas short-length rpsD mRNA transcripts were up-regulated during the persistent infection. This demonstrated that the rpsD promoter is activated during the persistent infection and that because of the collision of the RNA polymerases full length transcripts were down-regulated. This sigma factor-independent mechanism is known as ‘Transcriptional Interference’. This is the first description on how the alternative sigma factor rpsD might be down-regulated during persistent infections. Finally, the host cell transcriptome was analyzed in the acute and persistent infection mediated by the depletion of iron. Cpn infection triggered the upregulation of relB, involved in an alternative NF-KB signaling pathway. Several genes coding for cell cycle proteins were triggered, including cyclin G2 and cyclin D1 and inhibitors of CDK4. Taken together, this work provides insights into the modulation of the pathogen and the host transcriptome during the acute infection and the iron mediated persistent infection. / Das obligat intrazelluläre, gram-negative Bakterium Chlamydophila pneumoniae (Cpn) wird mit akuten und chronischen Krankheiten in Verbindung gebracht. Besonders sein Potential persistente Infektionen zu durchlaufen ist mit chronischen Krankheiten korreliert worden und deshalb von besonderem Interesse. Verschiedene in vitro Zellkulturmodelle werden verwendet um persistente Infektionen zu untersuchen, darunter IFN_ Stimulation, Antibiotika Behandlung und Eisenmangel. Über die Genregulation von Cpn als auch der Wirtzelle in der akuten und persistenten Infektion ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde das Cpn Transkriptom als auch das von epithelialen Wirtszellen in der akuten und in der durch Eisenmangel induzierten Infektion untersucht. Mittels eines Algorithmuses für ‚selbstorganisierende Netzwerke’ (SOM) wurden signifikant regulierte Gene aufgrund ihres Expressionsprofiles in 12 Cluster gegliedert. Diese 12 Cluster wurden wiederum in die Klassen der ‘Frühen’ (engl.: ‘Early’), ‘Mittleren’ (engl.: ‘Mid’) und ‘Späten’ (engl.: ‘Late’) Gene eingeteilt. Diese Unterteilung lehnt sich an schon beschriebenen Genexpressionsstudien für Ctr an. Weiterhin wurde die neue Klasse der ‘Verspäteten’ (engl.: ‘Tardy’) Gene eingeführt. Diese hatten am Ende des Entwicklungszykluses ein kontinuierlich ansteigendes Expressionsprofil. Mit publizierten Proteinen aus chlamydialen Elementarkörperchen (EK) korrelierten vor allem Gene aus den ‘Späte’ jedoch nicht aus den ‘Verspätete’ Klassen. Gene dieser beiden Klassen müssen also eine unterschiedliche Rolle im EK Redifferenzierungsprozess spielen. Weiterhin waren überdurchschnittlich viele mRNA Transkripte aus der Klasse der ‘Verspäteten’ Gene in den EK vorhanden. Dies führte zu der Annahme, daß ein Teil der initiale Proteinexpression von stabilen mRNA-Transkripten aus der infektiösen EK Form erfolgt. Anschließend wurden, Gene, die für spezifische Signalwege und physiologische Funktionen von Cpn kodieren, basierend auf der ‚Gene Ontology’ während des Entwicklungszykluses untersucht. Weiterhin wurde das Transkriptom von Cpn in der Persistenz mit dem Transkriptom der akuten Infektion verglichen. Unter Persistenzbedingungen zeigte Cpn ein verändertes Expressionsprofil. Hochregulierte Gene konnten akuten Clustern am Anfang des akuten Entwicklungszykluses und herunterregulierte Gene Clustern am Ende des akuten Entwicklungszykluses zugeordnet werden konnten. Dies legt nahe, daß es sich bei der Persistenz nicht um ein neues Transkriptionsprofil handelt, sondern eher um eine Arretierung des Transkriptomes in der Mitte des akuten Entwicklungszykluses. Weiterhin zeigten konvergent und divergent orientierte Gene am Anfang des Zyklus bevorzugt ein antagonistisches Expressionsprofil, während in Reihe angeordnete (‘tandem’) Gene ein korreliertes Expressionsprofil aufwiesen. Bei den mit dem Cpn Stamm CWL029 durchgeführten Mikroarrayexperimenten konnten auch Expressionswerte für einige ausschließlich für die Stämme AR39 und J138 beschriebenen Gene gemessen werden. Ein Vergleich mittels BLAST zeigte, daß diese Gene auch im CWL029 Genom kodiert sind. Dazu gehörten mehrere Gene, welche konvergent zu ihren Nachbargenen orientiert waren und eine Sequenzüberlappung mit diesen aufwiesen. Darunter fielen parB, welches eine Rolle für die Trennung der DNA in der Zellteilung spielt, und rpsD, ein alternativer Sigma-Faktor, der für die Transkription in der späten Phase des Entwicklungszyklus verantwortlich ist. Für beide Genpaare konnte in der frühen akuten und in der persistenten Infektion ein antagonistisches Expressionsprofil beobachtet werden, wie es bei konvergent orientierten Genpaaren überwiegt. Mittels quantitativer qRT-PCR wurde für rpsD gezeigt, dass vollständige mRNA-Fragmente in der Persistenz herunterreguliert, während kurze mRNA-Fragmente hochreguliert waren. Als Erklärung für diesen Effekt dient ein Modell, welches auf einer Kollision der RNA Polymerasen basiert. Dieser Sigma-Faktor unabhängige Mechanismus ist in der Literatur als ‘Transkriptionelle Interferenz’ bekannt und führt so trotz einer Promoteraktivierung zu einer verminderten Anzahl an vollständigen mRNA Transkripten. Die Herunterregulation von RpsD auf Proteinebene in der Cpn Persistenz ist beschrieben worden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Wirtszelltranskriptom in der akuten und persistenten Infektion untersucht.Infektion mit Cpn führte zu einer Hochregulation von relB, welches an alternativen NF-KB Signalwegen beteiligt ist und das anti-apoptotische Potential verstärkt. Weiterhin waren Gene differentiell exprimiert, welche für die Zellzyklusproteine Cyclin-G2 und Cyclin-D1 sowie Inhibitoren von CDK4 kodieren. Zusammenfassend gibt diese Arbeit gibt einen Einblick sowohl in das Transkriptom des Pathogens als auch der Wirtszelle während der akuten und durch Eisenmangel ausgelösten persistenten Infektion als auch potentiellen Mechanismen zu Persistenzentstehung auf der Ebene der Genregulation.

The transcriptome is defined as the set of all RNA molecules transcribed in a cell. These include protein-coding messenger RNAs (mRNAs) as well as non-coding RNAs, such as ribosomal RNAs (rRNAs), transfer RNAs (tRNAs), and small non-coding RNAs (sRNAs). sRNAs are known to play an important role in regulating gene expression and virulence in pathogens. In this thesis, the transcriptome of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni was characterized at single nucleotide resolution by use of next-generation sequencing approaches. The first genome of a C. jejuni strain was published in the year 2000. However, its transcriptome remained uncharacterized at large. C. jejuni can survive in a variety of ecological niches and hosts. However, how strain-specific transcriptional changes contribute to such adaptation is not known. In this study, the global transcriptome maps of four closely related C. jejuni strains were defined using a differential RNA-seq (dRNA-seq) approach. This analysis also included a novel automated method to annotate the transcriptional start sites (TSS) at a genome-wide scale. Next, the transcriptomes of four strains were simultaneously mapped and compared by the use of a common coordinate system derived from whole-genome alignment, termed as SuperGenome. This approach helped to refine the promoter maps by comparison of TSS within strains. Most of the TSS were found to be conserved among all four strains, but some single-nucleotide-polymorphisms (SNPs) around promoter regions led to strain-specific transcriptional output. Most of these SNPs altered transcription only slightly, but some others led to a complete abrogation of transcription leading to differential molecular phenotypes. These in turn might help the strains to adapt to their specific host or microniche. The transcriptome also unveiled a plethora of sRNAs, some of which were conserved among the four strains while others were strain specific. Furthermore, a Cas9-dependent minimal type-II CRISPR-Cas system with only three Cas genes and multiple promoters to drive the transcription of the CRISPR locus was also characterized in C. jejuni using the dRNA-seq dataset. Apart from sRNAs, the role of global RNA binding proteins (RBPs) is also unclear in C. jejuni. Aided by the global transcriptome data, the role of RBPs in post-transcriptional regulation of C. jejuni was studied at a global scale. Two of the most widely studied RNA binding proteins in bacteria are Hfq and CsrA. The RNA interactome of the translational regulator CsrA was defined using another global deep-sequencing technique that combines co-immunoprecipitation (coIP) with RNA sequencing (RIP-seq). Using this interactome dataset, the direct targets of this widespread global post-transcriptional regulator were defined, revealing a significant enrichment for mRNAs encoding genes involved in flagella biosynthesis. Unlike Gammaproteobacteria, where sRNAs such as CsrB/C, antagonize CsrA activity, no sRNAs were enriched in the CsrA-coIP in C. jejuni, indicating absence of any sRNA antagonists and novel modes of CsrA activity regulation. Instead, the CsrA regulatory pathway revealed flaA mRNA, encoding the major flagellin, as a dual-function mRNA. flaA mRNA was the main target of CsrA but it also served to antagonize CsrA activity along with the protein antagonist FliW previously identified in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Furthermore, this regulatory mRNA was also shown in this thesis to localize to the poles of elongating C. jejuni cells in a translation-dependent manner. It was also shown that this localization is dependent on the CsrA-FliW regulon, which controls the translation of flaA mRNA. The role and mechanism of flaA mRNA localization or mRNA localization in general is not yet clear in bacteria when compared to their eukaryotic counterparts. Overall, this study provides first insights into riboregulation of the bacterial pathogen C. jejuni. The work presented in this thesis unveils several novel modes of riboregulation in C. jejuni, which could be applicable more generally. Moreover, this study also lays out several unsolved intriguing questions, which may pave the way for interesting studies to come. / Das Transkriptom ist definiert als die Summe aller RNA-Moleküle, die in einer Zelle transkribiert werden. Hierzu gehören sowohl protein-kodierende Boten-RNAs (mRNAs für „messenger RNAs“), als auch nicht-kodierende RNAs, wie ribosomale RNAs (rRNAs), transfer RNAs (tRNAs) und kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs für „small RNAs“). Diese sRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Regulierung von Genexpression und Virulenz von Pathogenen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Transkriptom des Lebensmittelkeims Campylobacter jejuni mit Hilfe von Next-Generation-Sequencing-Methoden charakterisiert, welche eine Auflösung des Transkriptoms auf Einzelnukleotid-Ebene ermöglichen. Obwohl eine erste Genomsequenz für C. jejuni bereits im Jahr 2000 veröffentlicht wurde, war das Transkriptom bisher größtenteils uncharakterisiert. C. jejuni besitzt die Fähigkeit in vielen ökologischen Nischen und Wirten überleben zu können. Es ist jedoch bislang unbekannt, wie stammspezifische Veränderungen des Transkriptoms zu dieser Adaption beitragen. Mittels eines differenziellen RNA-Sequenzierungsansatzes wurden in dieser Arbeit globale Transkriptomkarten von vier nahverwandten C. jejuni Stämmen erstellt. Diese Analyse beinhaltet auch eine neue automatisierte Methode zur genomweiten Identifizierung von Transkriptionsstartstellen (TSS). Anschließend wurde aus den Genomsequenzen der vier Campylobacter Stämme ein SuperGenom erstellt. Dieses wiederum diente als Referenz, anhand dessen die Transkriptome kartiert und miteinander verglichen werden konnten. Dieser Ansatz ermöglichte eine verfeinerte Kartierung der Promotoren mittels des Vergleichs verschiedener Stämme. Die meisten TSS waren innerhalb der vier Stämme konserviert. Allerdings kam es durch SNPs („single-nucleotide polymorphisms“) in den Promoterregionen zu stammspezifischem Transkriptoutput. Die meisten dieser SNPs hatten nur geringe Veränderungen der Transkription zur Folge. Manche jedoch führten zu einem kompletten Verlust der Transkription und damit zu verschiedenen molekularen Phänotypen. Diese wiederum könnten es den verschiedenen Stämmen ermöglichen, sich an ihre spezifische Wirts- oder Mikronische anzupassen. Das Transkriptom wies auch eine Fülle von sRNAs auf, von denen manche in allen vier Stämmen konserviert, andere jedoch stammspezifisch waren. Zudem wurde mittels des C. jejuni-dRNA-seq-Datensatzes ein minimales Cas9-abhängiges CRISPR-Cas-System des Typs II entdeckt. Dieses beinhaltet lediglich drei Cas-Gene, jedoch mehrere Promotoren, die die Expression des CRISPR-Lokus antreiben. Neben der Funktion von sRNAs ist auch die Rolle globaler RNA-Bindeproteine (RBPs) in C. jejuni weitestgehend unklar. Mithilfe der Transkriptomdaten wurde die Rolle von RBPs in der posttranskriptionellen Regulierung in C. jejuni untersucht. Zwei der am besten untersuchten RNA-Bindeproteine in Bakterien sind Hfq und CsrA. Das RNA-Interaktom des Translationsregulators CsrA wurde mittels eines weiteren globalen Deep-Squencing-Ansatzes definiert. Bei dieser Methode werden Coimmunopräzipitation (coIP) und RNA-Sequenzierung zum so genannten RIP-seq kombiniert. Mithilfe dieses Interaktionsdatensatzes wurden die Zielgene dieses weitverbreiteten, globalen posttranskriptionellen Regulators definiert. Hierbei wurde eine signifikante Anreicherung von mRNAs, die in die Biosynthese von Flagellen involviert sind, erkennbar. Anders als in Gammaproteobakterien, in denen sRNAs wie CsrB und CsrC die CsrA-Aktivität antagonisieren, wurden in C. jejuni keine sRNAs in der CsrA-CoIP angereichert. Dies deutet auf das Fehlen jeglicher sRNA-Antagonisten, und damit auf eine neue Art der CsrA-Aktivitätskontrolle hin. Anstelle der sRNAs wurde die flaA mRNA, welche für das Hauptflagellin kodiert, als mRNA mit dualer Funktion identifiziert. Sie ist zum einen das Hauptzielgen von CsrA, fungiert aber gleichzeitig, zusammen mit dem Protein FliW, als Antagonist von CsrA. FliW wurde bereits zuvor in dem Grampositiven Bakterium Bacillus subtilis identifiziert. In dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass die regulatorische flaA mRNA translationsabhängig an den Polen der wachsenden C. jejuni-Zellen lokalisiert ist. Außerdem war zu erkennen, dass diese Lokalisierung abhängig von dem CsrA-FliW-Regulon stattfindet, welches die Translation der flaA-mRNA kontrolliert. Im Gegensatz zu Eukaryoten ist die Rolle, die die Lokalisation der flaA-mRNA, oder bakterieller mRNA im Allgemeinen, spielt, sowie der Mechanismus, der zu dieser Lokalisierung führt, bisher noch unklar. Zusammenfassend ermöglicht diese Arbeit einen ersten Einblick in die Riboregulierung des bakteriellen Pathogens C. jejuni. Es konnten einige neue Mechanismen dieser Art der Regulierung aufgedeckt werden, welche auch allgemeine Gültigkeit finden könnten. Zudem werden in dieser Arbeit neue, faszinierende Fragen aufgeworfen, die den Weg für weitere interessante Studien bereiten.

It is well documented that transcriptionally coordinated genes tend to be functionally related, and that such relationships may be conserved across different species, and even kingdoms. (Ihmels et al., 2004). Such relationships was initially utilized to reveal functional gene modules in yeast and mammals (Ihmels et al., 2004), and to explore orthologous gene functions between different species and kingdoms (Stuart et al., 2003; Bergmann et al., 2004). Model organisms, such as Arabidopsis, are readily used in basic research due to resource availability and relative speed of data acquisition. A major goal is to transfer the acquired knowledge from these model organisms to species that are of greater importance to our society. However, due to large gene families in plants, the identification of functional equivalents of well characterized Arabidopsis genes in other plants is a non-trivial task, which often returns erroneous or inconclusive results. In this thesis, concepts of utilizing co-expression networks to help infer (i) gene function, (ii) organization of biological processes and (iii) knowledge transfer between species are introduced. An often overlooked fact by bioinformaticians is that a bioinformatic method is as useful as its accessibility. Therefore, majority of the work presented in this thesis was directed on developing freely available, user-friendly web-tools accessible for any biologist. / Es ist bereits ausgiebig gezeigt worden, dass Gene, deren Expression auf Transkriptionsebene koordiniert ist, häufig auch funktional in verwandten Stoffwechselwegen vorkommen, und dass sich dies wahrscheinlich auch Spezies- und sogar Reichübergreifend sagen lässt (Ihmels et al., 2004). Anfänglich wurden solche Beziehungen verwendet, um sogenannte Genfunktionsmodule in Hefe und Säugern aufzudecken (Ihmels et al., 2004), um dann orthologe Genfunktionen zwischen verschiedene Spezies und Reichen zu entdecken (Stuart et al., 2003; Bergmann et al., 2004). Modellorganismen wie Arabidopsis werden bevorzugt in der Forschung verwendet, weil man durch die schnelle Generationszeit in kurzer Zeit viele Daten erheben kann und aufgrund dessen die Ressourcen- und Informationsvielfalt um ein Vielfaches größer ist. Ein Hauptziel ist der Wissenstransfer von Modellorganismen auf Spezies, die gesellschaftlich von höherer Bedeutung sind wie z.B. Getreidearten oder andere Feldfrüchte. Pflanzen besitzen oft große Genfamilien und die eindeutige Identifizierung von gut charakterisierten Arabidopsisorthologen in besagten Nutzpflanzen ist kein triviales Vorhaben. In der vorliegenden Arbeit werden Konzepte zur Nutzung von Co-expressionsnetzwerken beschrieben, die helfen sollen (i) Genfunktionen zu identifizieren, (ii) die Organisation von biologischen Prozessen aufzuklären und (iii) das erworbene Wissen auf andere Spezies übertragbar zu machen. Ein häufig von Bioinformatikern übersehender Umstand ist, dass bioinformatische Methoden nur so sinnvoll sind wie ihre Zugänglichkeit. Deshalb basiert der Großteil dieser Arbeit auf freiverfügbaren und vor allem für Biologen nutzerfreundlichen Webtools.

All living organisms leverage mechanisms and response systems to optimize reproduction, defense, survival, and competitiveness within their natural habitat. Evolutionary theories such as the universal adaptive strategy theory (UAST) developed by John Philip Grime (1979) attempt to describe how these systems are limited by the trade-off between growth, maintenance and regeneration; known as the universal three-way trade-off. Grime introduced three adaptive strategies that enable organisms to coop with either high or low intensities of stress (e.g., nutrient deficiency) and environmental disturbance (e.g., seasons). The competitor is able to outcompete other organisms by efficiently tapping available resources in environments of low intensity stress and disturbance (e.g., rapid growers). A ruderal specism is able to rapidly complete the life cycle especially during high intensity disturbance and low intensity stress (e.g., annual colonizers). The stress tolerator is able to respond to high intensity stress with physiological variability but is limited to low intensity disturbance environments. Carnivorous plants like D. muscipula and tardigrades like M. tardigradum are two extreme examples for such stress tolerators. D. muscipula traps insects in its native habitat (green swamps in North and South Carolina) with specialized leaves and thereby is able to tolerate nutrient deficient soils. M. tardigradum on the other side, is able to escape desiccation of its terrestrial habitat like mosses and lichens which are usually covered by a water film but regularly fall completely dry. The stress tolerance of the two species is the central study object of this thesis. In both cases, high througput sequencing data and methods were used to test for transcriptomic (D. muscipula) or genomic adaptations (M. tardigradum) which underly the stress tolerance. A new hardware resource including computing cluster and high availability storage system was implemented in the first months of the thesis work to effectively analyze the vast amounts of data generated for both projects. Side-by-side, the data management resource TBro [14] was established together with students to intuitively approach complex biological questions and enhance collaboration between researchers of several different disciplines. Thereafter, the unique trapping abilities of D. muscipula were studied using a whole transcriptome approach. Prey-dependent changes of the transcriptional landscape as well as individual tissue-specific aspects of the whole plant were studied. The analysis revealed that non-stimulated traps of D. muscipula exhibit the expected hallmarks of any typical leaf but operates evolutionary conserved stress-related pathways including defense-associated responses when digesting prey. An integrative approach, combining proteome and transcriptome data further enabled the detailed description of the digestive cocktail and the potential nutrient uptake machinery of the plant. The published work [25] as well as a accompanying video material (https://www.eurekalert.org/pub_releases/ 2016-05/cshl-fgr042816.php; Video credit: Sönke Scherzer) gained global press coverage and successfully underlined the advantages of D. muscipula as experimental system to understand the carnivorous syndrome. The analysis of the peculiar stress tolerance of M. tardigradum during cryptobiosis was carried out using a genomic approach. First, the genome size of M. tardigradum was estimated, the genome sequenced, assembled and annotated. The first draft of M. tardigradum and the workflow used to established its genome draft helped scrutinizing the first ever released tardigrade genome (Hypsibius dujardini) and demonstrated how (bacterial) contamination can influence whole genome analysis efforts [27]. Finally, the M. tardigradum genome was compared to two other tardigrades and all species present in the current release of the Ensembl Metazoa database. The analysis revealed that tardigrade genomes are not that different from those of other Ecdysozoa. The availability of the three genomes allowed the delineation of their phylogenetic position within the Ecdysozoa and placed them as sister taxa to the nematodes. Thereby, the comparative analysis helped to identify evolutionary trends within this metazoan lineage. Surprisingly, the analysis did not reveal general mechanisms (shared by all available tardigrade genomes) behind the arguably most peculiar feature of tardigrades; their enormous stress tolerance. The lack of molecular evidence for individual tardigrade species (e.g., gene expression data for M. tardigradum) and the non-existence of a universal experimental framework which enables hypothesis testing withing the whole phylum Tardigrada, made it nearly impossible to link footprints of genomic adaptations to the unusual physiological capabilities. Nevertheless, the (comparative) genomic framework established during this project will help to understand how evolution tinkered, rewired and modified existing molecular systems to shape the remarkable phenotypic features of tardigrades. / Alle lebenden Organismen verwenden Mechanismen und Rückkopplungssysteme um Reproduktion, Überlebenswahrscheinlichkeit, Abwehreffizienz und Konkurrenzfähigkeit in ihrem natürlichen Habitat zu optimieren. Evolutionäre Theorien, wie die von John Philip Grime (1979) entwickelte „universal adaptive strategy theory“ (UAST), versuchen zu beschreiben wie diese Systeme durch eine Balance zwischen Wachstum, Erhaltung und Regeneration, auch gemeinhin bekannt als universeller Dreiwege-Ausgleich, des jeweiligen Organismus limitiert sind. Grime führte dazu drei adaptive Strategien ein, die es Organismen ermöglicht sich an hohe oder niedrige Stress-Intensitäten (z.B. Nahrungsknappheit) oder umweltbedingte Beeinträchtigung (z.B. Jahreszeiten) anzupassen. Der Wettkämpfer ist in der Lage seine Konkurrenz durch eine effiziente Ressourcengewinnung zu überflügeln und ist vor allem bei niedrigem Stresslevel und minimalen umweltbedingten Beeinträchtigungen effizient (z. B. schnelles Wachstum). Ruderale Organismen hingegen durchlaufen den Leben- szyklus in kurzer Zeit und sind damit perfekt an starke umweltbedingte Beeinträchtigungen, wie zum Beispiel Jahreszeiten, angepasst. Allerdings können auch sie nur bei niedrigen Stresslevel effizient wachsen. Die letzte Gruppe von Organismen, die Stresstoleranten sind in der Lage sich an hohen Stressintensitäten mithilfe extremer physiologischer Variabilität anzupassen, können das allerdings nur in Umgebungen mit niedrigen umweltbedingten Beeinträchtigungen. Fleischfressende Pflanzen wie die Venusfliegenfalle (D. muscipula) oder Bärtierchen (M. tardigradum) sind zwei herausragende Beispiele für stresstolerante Organismen. Die Venusfliegenfalle ist in der Lage Insekten mit spezialisierten Blätter, welche eine einzigartige Falle bilden, zu fangen. Die Pflanze kompensiert so die stark verminderte Mengen an wichtigen Makronährstoffen (z.B. Stickstoff) in den Sümpfen von Nord- und Süd-Carolina. Bärtierchen dagegen sind in der Lage in schnell austrocknenden Habitaten wie Moosen oder Flechten, die normalerweise mit einem Wasserfilm überzogen sind, durch eine gesteuerte Entwässerung ihres Körpers zu überleben. Die Stresstoleranz beider Spezies ist zentraler Forschungsschwerpunkt dieser Dissertation. In beiden Fällen wer- den Hochdurchsatz-Methoden zur Sequenzierung verwendet um genomische (Bärtierchen) sowie transkriptomische (Venusfliegenfalle) Anpassungen zu identifizieren, die der enorem Stresstoleranz zugrunde liegen. Um den erhöhten technischen Anforderungen der Datenanal- ysen beider Projekte Rechnung zu tragen wurde in den ersten Monaten der Dissertation eine neue zentrale Rechenumgebung und ein dazugehöriges Speichersystem etabliert. Parallel wurde die Datenmanagementplattform TBro [14] zusammen mit Studenten aufgesetzt, um komplexe biologische Fragestellung mit einem fachübergreifendem Kollegium zu bearbeiten. Danach wurden die einzigartigen Fangfähigkeiten der Venusfliegenfalle mittels einem tran- skriptomischen Ansatz untersucht. Vor allem wurden transkriptionelle Änderungen infolge eines Beutefangs sowie gewebespezifische Aspekte der ruhenden Pflanzen untersucht. Die Analyse zeigte deutlich, dass die Fallen der fleischfressenden Pflanze immer noch Merkmale von typischen „grünen“ Blättern aufweisen. Während des Beutefangs und -verdauens jedoch wird eine Vielzahl an evolutionär konservierten Systemen aktiviert, die bisher nur mit Stres- santworten und zellulärer Verteidigung in Verbindung gebracht worden sind. Die Integration von proteomischen und transkriptomischen Hochdurchsatzdaten ermöglichte es zudem den Verdauungssaft der Venusfliegenfalle genaustens zu beschreiben und wichtige Komponenten der Aufnahmemaschinerie zu identifizieren. Die wissenschaftliche Arbeit [25] und das beglei- tende Videomaterial (https://www.eurekalert.org/pub_releases/2016-05/cshl-fgr042816.php; Video credit: Sönke Scherzer) erfreute sich einer breiten Berichterstattung in den Medien und unterstreicht die Vorteile der Venusfliegenfalle als experimentelles System um fleis- chfressende Pflanzen besser zu verstehen. Die genomische Analyse des Bärtierchen (M. tardigradum) zielte auf die außerordentliche Stresstoleranz, vor allem auf die Kryptobiose, einen Zustand in dem Stoffwechselvorgänge extrem reduziert sind, ab. Dazu wurden das komplette genetische Erbgut (Genom) entschlüsselt. Die Größe des Genomes wurde bes- timmt und das Erbgut mittels Sequenzierung entschlüsselt. Die gewonnenen Daten wurden zu einer kontinuierlichen Sequenz zusammengesetzt und Gene identifiziert. Der dabei etablierte Arbeitsablauf wurde verwendet um ein weiteres Bärtierchengenom genau zu überprüfen. Im Rahmen dieser Analyse stellte sich heraus, dass eine große Anzahl an Kontaminationen im Genom von H. dujardini vorhanden sind [27]. Das neu etablierte Genom von M. tardigradum wurde im folgenden verwendet um einen speziesübergreifenden Vergleich dreier Bärtierchen und aller Spezies aus der Metazoadatenbank von Ensembl durchzuführen. Die Analyse zeigte, dass Bärtierchengenome sehr viel Ähnlichkeit zu den bereits veröffentlichten Genomen aus dem Überstamm der Urmünder (Protostomia) aufweisen. Die erstmalige Verfügbarkeit aller Bärtierchengenome ermöglichte es zudem, das Phylum der Bärtierchen als Schwester der Nematoden mittels einer phylogenomische Analyse zu platzieren. Die vergleichende Anal- yse identifizierte außerdem zentrale evolutionäre Trends, vor allem einen enormen Verlust an Genen in dieser Linie der Metazoa. Die Analyse ermöglichte es aber nicht, generelle Mechanismen, die zur enormen Stresstoleranz in Bärtierchen führen, artübergreifend zu identifizieren. Vor allem das Fehlen von weiteren molekularen Daten für einzelne Bärtierchen- spezies (z.B. transkriptionelle Daten für M. tardigradum) machten es unmöglich die wenigen genomische Adaptionen mit den physiologischen Besonderheiten der Bärtierchen in Deckung zu bringen. Nichtsdestotrotz konnten die vergleichenden Analysen zeigen, dass Evolution auch innerhalb der Bärtierchen verschiedenste Systeme neu zusammensetzt, neue Funktionen erschafft oder bestehenden Systeme modifiziert und damit die außerordentliche phänotypis- che Variabilität ermöglicht.