Le S23906-1 est un dérivé diacétate de la benzo-[b]-acronycine. Sélectionné pour son potentiel cytotoxique in vitro et son activité anti-tumorale in vivo, ce composé très prometteur est entré en essai clinique en 2006-2007. Cet agent alkylant présente la particularité d’interagir avec l’azote en position 2 des guanines localisé dans le petit sillon de l’ADN et d’induire ensuite une ouverture locale de la double hélice. La conformation de ce composé est importante pour son activité puisque la présence du groupement réactif acétate en orientation S induit une plus forte déstabilisation de l’ADN par rapport à l’orientation R, ceci en corrélation avec une plus forte cytotoxicité et une meilleure activité anti-tumorale. Cependant le mécanisme moléculaire mis en place, pour conduire à la mort de la cellule tumorale reste peu connu. Afin de mieux comprendre le lien entre la déstabilisation de l’ADN et l’activité cytotoxique du S23906-1, nous avons cherché à déterminer la nature des protéines nucléaires qui reconnaissent spécifiquement cette lésion. Une approche protéomique par chromatographie d’affinité suivie d’une électrophorèse séparative et d’analyse en MALDI-TOF nous a permis d’identifier la GAPDH. Des expériences de retard en gel ont validé l’interaction de la GAPDH à l’adduit S23906-1/ADN simple ou double brin. La recherche d’une éventuelle séquence consensus de fixation à l’ADN de la GAPDH a été entreprise par méthode de CASTing. Si aucun consensus proprement-dit n’est clairement apparu, une prévalence de fixation pour les séquences riches en guanines a été observée. Des études de relation structure/fonction ont montré les adduits formés par les dérivés diacétylés ou benzo-[a]-diacétylés de l’acronycine déstabilisent également l’ADN et que la GAPDH se fixe également de manière efficace à ces adduits. Par comparaison à d’autres composés interagissant au niveau de l’azote 2 des guanines, nous n’avons observé aucune interaction de la GAPDH avec l’adduit ET-743/ADN (l’ET-743 stabilise l’ADN), alors que d’autres auteurs ont mis en évidence une interaction avec l’adduit QAD/ADN, où QAD est un dérivé de la Saframycine A, molécule structurellement proche de l’ET-743. Au niveau cellulaire, un traitement au composé QAD engendre une translocation de la GAPDH du cytoplasme vers le noyau. Nous n'avons pas retrouvé une telle translocation en utilisant le S23906-1. De plus, et contrairement à ce dérivé de la Saframycine A, nos cellules traitées avec un siRNA dirigé contre la GAPDH sont plus résistantes au S23906-1, suggérant un rôle anti-apoptotique de la GAPDH suite au traitement au S23906-1, contrairement à l’effet pro-apoptotique observé avec le dérivé QAD de la Saframycine A. En parallèle, nous nous sommes intéressés à de nouveaux agents cytotoxiques, dont des composés de série benzylamine bis-8-hydroxyquinoline. En utilisant des approches spectrométriques et biochimiques, nous avons montré que le composé principal JLK1486 ne cible pas l'ADN, mais réagit de manière covalente avec des groupements thiol comme celui du glutathion. Cependant, des études cellulaires de déplétion du glutathion endogène ont montré que le glutathion n’était pas la cible du composé JLK1486 mais participait à sa détoxification. Afin d’identifier la ou les cible(s) protéique(s) responsable(s) de l’effet cytotoxique du JLK1486, nous avons mis au point une approche dérivée de l’électrophorèse 2D-DIGE. / S23906-1 is a diacetate benzo-[b] acronycine derivative. Selected for its cytotoxic potential in vitro and its antitumoral activity in vivo, this very promising compound entered clinical trial in 2006-2007. This alkylating agent presents the peculiarity to interact with the nitrogen in position 2 (N2) of guanines, localized in the minor groove of the DNA, and to subsequently lead local opening of the double helix. The conformation of this compound is important for its activity. Indeed, the presence of the active acetate group in the S-orientation leads to a stronger destabilization of the DNA with regard to the R-orientation, in correlation with a stronger cytotoxicity and a better antitumoral activity of the S- rather than R-stereoisomer. However, the molecular mechanism leading to the death of treated tumoral cell lines remains poorly understood. To address the link between the destabilization of the DNA and the cytotoxic activity of the S23906-1, we tried to determine the nature of nuclear proteins that specifically recognize this lesion. A proteomic approach, using chromatographic affinity followed by SDS-PAGE electrophoresis and MALDI-TOF analysis, identified the GAPDH protein. EMSA experiments validated the interaction of GAPDH to the S23906-1/DNA adduct (as a single- or double-stranded DNA template). The search for a possible consensus DNA-binding sequence of GAPDH was performed using a CASTing method. Even though no consensus site was clearly identified, prevalence for G-rich and GT-rich sequences was evidenced. From structure/activity relationships studies, we showed that DNA alkylation using the diacetylated or benzo-[a]-diacetylated forms of acronycine also destabilize the DNA helix and that GAPDH also binds in an efficient manner to these adducts. By comparison to other compounds also interacting with the N2 group of guanines, no interaction of the GAPDH with the ET-743/ADN adduct was evidenced (ET-743 stabilizes the DNA), while other authors evidenced an interaction with DNA of QAD, a Saframycine A derivative and a molecule structurally related to ET-743. At the cellular level, cellular treatment with the QAD resulted in GAPDH translocation from the cytoplasm to the nucleus. We did not observe such a translocation using S23906-1. Furthermore cells treated with a siRNA directed to the GAPDH are more resistant to S23906-1, suggesting an anti-apoptotic role of GAPDH after S23906-1 treatment, by contrast with the pro-apoptotic effect observed in the literature with QAD . In parallel, we were interested in new cytotoxic agents, among which abis-8-hydroxyquinoline benzylamine series. Using spectrometric and biochemical approaches, we showed that the lead compound JLK1486 does not target DNA, but covalently reacts with thiol groups as that of the glutathione. However, cellular studies using depletion of the endogenous glutathione showed that the glutathione was not the target of JLK1486 but that it participated in its detoxification as it does for S23906-1. To identify the protein(s) target(s) responsible for the cytotoxic effect of JLK1486, we developed an approach derived from the 2D-DIGE electrophoresis which clearly evidenced proteins that are the cellular targets for JLK1486.

L’adénocarcinome pancréatique canalaire est un cancer de mauvais pronostic avec une survie à 5 ans inférieure à 5% et une médiane de survie d’environ 6 mois. Dès les stades précoces de la carcinogenèse pancréatique, la mucine membranaire MUC1, glycoprotéine de haute masse moléculaire, est surexprimée et présente des anomalies de distribution cellulaire, essentiellement une délocalisation membranaire vers le pôle basolatéral et une rétention à l’intérieur de la cellule. Sachant que MUC1 est capable d’interagir avec l’EGFR et de jouer un rôle sur la transduction des signaux, cette séquestration pourrait être à l’origine de signaux oncogéniques et est utilisée par les pathologistes comme indicateur de malignité après ponction sur des lésions pancréatiques. Cependant, les mécanismes permettant cette rétention cytoplasmique ne sont pas connus. Des études antérieures du laboratoire ont montré que le trafic de certaines glycoprotéines vers la membrane apicale des cellules épithéliales était dépendant de la Galectine 4. Dans ce travail, nous nous intéresserons à la Galectine 3, lectine endogène susceptible d’interagir avec les motifs glycanniques des mucines et aussi des récepteurs membranaires. Cette Galectine est surexprimée dans le cancer pancréatique et son expression est corrélée à une forte agressivité tumorale dans d’autres cancers. Le but de ce travail a été dans un premier temps de mettre au point des lignées cellulaires pancréatiques polarisées CAPAN-1 Knocked-down pour la Galectine-3. Dans un second temps d’étudier l’implication de la Galectine-3 : (i) dans le trafic intracellulaire de MUC1 et l’EGFR (ii) dans l’interaction entre MUC1 et l’EGFR (iii) sur les voies de signalisation de l’EGFR.Les résultats montrent que les cellules tumorales pancréatiques CAPAN-1 présentent les anomalies de distribution cellulaire de MUC1 observées dans les tumeurs pancréatiques humaines, notamment la rétention de MUC1 à l’intérieur des cellules. Le silencing de la Galectine-3 entraîne la disparition de cette anomalie de distribution cellulaire, MUC1 retrouvant la distribution membranaire normale. Nous avons montré que l’inhibition de l’expression de la Galectine-3 est associée (i) à une augmentation de la translocation nucléaire de l’EGFR (ii) à une inhibition de l’endoyctose de MUC1 et de l’EGFR en condition de sevrage. Ce phénomène s’accompagne d’une augmentation de l’interaction entre MUC1 et l’EGFR et d’une activation accrue de ce récepteur tyrosine kinase lorsqu’il est soumis à l’EGF : augmentation de la phosphorylation de l’EGFR et augmentation de la phosphorylation des MAPK Erk1 et 2. Mots clés : Galectine, Mucine, EGFR, cancer, endocytose, translocation nucléaire / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is thought to derive from the epithelial ductal cells. In physiological state, the transmembrane mucin MUC1 is expressed at the apical pole where it protects the cell, senses the environment and modulates signal transduction notably by interacting with EGFR. In tumor cells, the localization of MUC1 is modified. MUC1 expression at the membrane becomes circumferential and accumulates in the cytoplasm. This sequestration is thought to deliver oncogenic signals to the cell, and is used by pathologists as an indicator of malignancy. Since it was previously demonstrated that endogenous lectins, especially galectin-3 (Gal-3) and -4, control the apical targeting of glycoproteins in epithelial cells, our aim was to study the role of Gal-3 in the control of MUC1 expression topography in PDAC, and in the cell invasiveness in vitro. Results/expected results: In control cells, we observed a strong MUC1 labeling in cytoplasm as in pathologic conditions. MUC1 was partially co-localized with M6PR in late endosomes. In KD cells, invalidation of Gal-3 led to a strong decrease of MUC1 cytoplasmic labeling. Gal-3 down-regulation is associated with a decrease of both MUC1 and EGFR protein levels by WB. However, KD Gal-3 cells expressed 2-fold higher levels of phosphoY1173EGFR in response to EGF treatment. Preliminary results showed that KD Gal-3 cells lost their in vitro invasive phenotype.Conclusions: Our data showed that Gal-3 is responsible for MUC1 cytoplasmic retention in pancreatic tumor cells. Silencing of Gal-3 promotes MUC1 localization at the cell membrane, and increases EGF-induced EGFR phosphorylation.keywords : Galectine, Mucine, EGFR, cancer, endocytose, translocation nucléaire

L'adénocarcinome pancréatique canalaire est un cancer de mauvais pronostic avec une survie à 5 ans inférieure à 5% et une médiane de survie d'environ 6 mois. Dès les stades précoces de la carcinogenèse pancréatique, la mucine membranaire MUC1, glycoprotéine de haute masse moléculaire, est surexprimée et présente des anomalies de distribution cellulaire, essentiellement une délocalisation membranaire vers le pôle basolatéral et une rétention à l'intérieur de la cellule. Sachant que MUC1 est capable d'interagir avec l'EGFR et de jouer un rôle sur la transduction des signaux, cette séquestration pourrait être à l'origine de signaux oncogéniques et est utilisée par les pathologistes comme indicateur de malignité après ponction sur des lésions pancréatiques. Cependant, les mécanismes permettant cette rétention cytoplasmique ne sont pas connus. Des études antérieures du laboratoire ont montré que le trafic de certaines glycoprotéines vers la membrane apicale des cellules épithéliales était dépendant de la Galectine 4. Dans ce travail, nous nous intéresserons à la Galectine 3, lectine endogène susceptible d'interagir avec les motifs glycanniques des mucines et aussi des récepteurs membranaires. Cette Galectine est surexprimée dans le cancer pancréatique et son expression est corrélée à une forte agressivité tumorale dans d'autres cancers. Le but de ce travail a été dans un premier temps de mettre au point des lignées cellulaires pancréatiques polarisées CAPAN-1 Knocked-down pour la Galectine-3. Dans un second temps d'étudier l'implication de la Galectine-3 : (i) dans le trafic intracellulaire de MUC1 et l'EGFR (ii) dans l'interaction entre MUC1 et l'EGFR (iii) sur les voies de signalisation de l'EGFR.Les résultats montrent que les cellules tumorales pancréatiques CAPAN-1 présentent les anomalies de distribution cellulaire de MUC1 observées dans les tumeurs pancréatiques humaines, notamment la rétention de MUC1 à l'intérieur des cellules. Le silencing de la Galectine-3 entraîne la disparition de cette anomalie de distribution cellulaire, MUC1 retrouvant la distribution membranaire normale. Nous avons montré que l'inhibition de l'expression de la Galectine-3 est associée (i) à une augmentation de la translocation nucléaire de l'EGFR (ii) à une inhibition de l'endoyctose de MUC1 et de l'EGFR en condition de sevrage. Ce phénomène s'accompagne d'une augmentation de l'interaction entre MUC1 et l'EGFR et d'une activation accrue de ce récepteur tyrosine kinase lorsqu'il est soumis à l'EGF : augmentation de la phosphorylation de l'EGFR et augmentation de la phosphorylation des MAPK Erk1 et 2. Mots clés : Galectine, Mucine, EGFR, cancer, endocytose, translocation nucléaire

Le S23906-1 est un dérivé diacétate de la benzo-[b]-acronycine. Sélectionné pour son potentiel cytotoxique in vitro et son activité anti-tumorale in vivo, ce composé très prometteur est entré en essai clinique en 2006-2007. Cet agent alkylant présente la particularité d'interagir avec l'azote en position 2 des guanines localisé dans le petit sillon de l'ADN et d'induire ensuite une ouverture locale de la double hélice. La conformation de ce composé est importante pour son activité puisque la présence du groupement réactif acétate en orientation S induit une plus forte déstabilisation de l'ADN par rapport à l'orientation R, ceci en corrélation avec une plus forte cytotoxicité et une meilleure activité anti-tumorale. Cependant le mécanisme moléculaire mis en place, pour conduire à la mort de la cellule tumorale reste peu connu. Afin de mieux comprendre le lien entre la déstabilisation de l'ADN et l'activité cytotoxique du S23906-1, nous avons cherché à déterminer la nature des protéines nucléaires qui reconnaissent spécifiquement cette lésion. Une approche protéomique par chromatographie d'affinité suivie d'une électrophorèse séparative et d'analyse en MALDI-TOF nous a permis d'identifier la GAPDH. Des expériences de retard en gel ont validé l'interaction de la GAPDH à l'adduit S23906-1/ADN simple ou double brin. La recherche d'une éventuelle séquence consensus de fixation à l'ADN de la GAPDH a été entreprise par méthode de CASTing. Si aucun consensus proprement-dit n'est clairement apparu, une prévalence de fixation pour les séquences riches en guanines a été observée. Des études de relation structure/fonction ont montré les adduits formés par les dérivés diacétylés ou benzo-[a]-diacétylés de l'acronycine déstabilisent également l'ADN et que la GAPDH se fixe également de manière efficace à ces adduits. Par comparaison à d'autres composés interagissant au niveau de l'azote 2 des guanines, nous n'avons observé aucune interaction de la GAPDH avec l'adduit ET-743/ADN (l'ET-743 stabilise l'ADN), alors que d'autres auteurs ont mis en évidence une interaction avec l'adduit QAD/ADN, où QAD est un dérivé de la Saframycine A, molécule structurellement proche de l'ET-743. Au niveau cellulaire, un traitement au composé QAD engendre une translocation de la GAPDH du cytoplasme vers le noyau. Nous n'avons pas retrouvé une telle translocation en utilisant le S23906-1. De plus, et contrairement à ce dérivé de la Saframycine A, nos cellules traitées avec un siRNA dirigé contre la GAPDH sont plus résistantes au S23906-1, suggérant un rôle anti-apoptotique de la GAPDH suite au traitement au S23906-1, contrairement à l'effet pro-apoptotique observé avec le dérivé QAD de la Saframycine A. En parallèle, nous nous sommes intéressés à de nouveaux agents cytotoxiques, dont des composés de série benzylamine bis-8-hydroxyquinoline. En utilisant des approches spectrométriques et biochimiques, nous avons montré que le composé principal JLK1486 ne cible pas l'ADN, mais réagit de manière covalente avec des groupements thiol comme celui du glutathion. Cependant, des études cellulaires de déplétion du glutathion endogène ont montré que le glutathion n'était pas la cible du composé JLK1486 mais participait à sa détoxification. Afin d'identifier la ou les cible(s) protéique(s) responsable(s) de l'effet cytotoxique du JLK1486, nous avons mis au point une approche dérivée de l'électrophorèse 2D-DIGE.

Le dogme voulant que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) activent des voies de signalisation seulement lorsqu’ils sont localisés à la membrane plasmatique, a récemment été remis en question. Des données récentes indiquent que certains GPCRs peuvent également induire une réponse intracellulaire à partir des compartiments intracellulaires dont le noyau. Les récepteurs activés par la protéase (PAR) sont des membres de la famille GPCR. Les PARs sont activés par le clivage de la partie N–terminale du récepteur ce qui permet au ligand attaché sur le récepteur de se lier à sa poche réceptrice. Quatre PARs ont été décrits : PAR1, PAR2, PAR3 et PAR4. PAR2 peut susciter des effets mitogéniques et participer aux processus comme l’angiogenèse et l'inflammation. Alors que beaucoup d'effets intracellulaires de PAR2 peuvent être expliqués lorsqu’il est localisé à la membrane plasmatique, une fonction intracrine de PAR2 a aussi été proposée. Pourtant les mécanismes par lesquels PAR2 peut provoquer l’expression de gènes ciblés sont toujours inconnus. Le but de notre étude était de vérifier l’existence d’une population nucléaire de PAR2. Nous avons également émis l’hypothèse que les voies activées par l’activation de PAR2 dépendent de sa localization cellulaire. En utilisant des techniques de microscopie confocale et de "Western Blot" nous avons démontré la présence d’une population nucléaire de PAR2. À la suite de la stimulation de PAR2, nous avons observé une augmentation de la translocation du récepteur de la membrane plasmatique au noyau. En utilisant la technique de "RT – PCR", nous avons observé des rôles différents de PAR2 à la surface de la cellule et du noyau dans l’initiation de l’expression des gènes. Afin d’identifier les mécanismes responsables de la translocation nucléaire de PAR2, nous avons évalué l’implication des membres de la famille de "Sorting Nexins (SNX)" dans la translocation nucléaire de PAR2. "Sorting Nexins" est un groupe de protéines avec des fonctions de transport bien établies. SNX1 et SNX2 ont été identifiés comme responsables du transfert de PAR1 vers les lysosomes. SNX11 n'a pas encore été étudié et nous avons émis l’hypothèse qu'il pourrait être un autre membre de la famille des SNX impliqué dans la signalisation de PAR2. Pour ce faire, nous avons développé des "knockdowns" stables pour SNX1, SNX2 et SNX11 dans les cellules HEK293. En utilisant les essais d’immunofluorescence, "Western Blot" et de cytométrie en flux, nous avons déterminé que tous les trois membres du groupe SNX sont des partenaires d'interaction de PAR2. Toutefois, seul SNX11 se co-localise avec son partenaire au noyau et est responsable de sa translocation nucléaire. Les expériences de "RT - PCR" sur les lignées de cellule de SNXs "knockdowns" ont démontré que la fonction de PAR2 nucléaire dépend surtout de SNX11; néanmoins SNX1 et SNX2 peuvent aussi l’influencer, suggérant qu'ils font aussi partie du réseau signalétique de PAR2. En conclusion, PAR2 est déplacé de la membrane plasmatique à la membrane nucléaire après sa stimulation avec un agoniste. La translocation nucléaire de PAR2 par un mécanisme impliquant SNX11, initie des effets intracellulaires différents de sa signalisation membranaire. Mots clés : récepteurs couplés à la protéine G, “Sorting Nexins”, récepteurs activés par la protéase, translocation nucléaire, membrane nucléaire, signal nucléaire. / During the recent years the existing statements that G – protein coupled receptors (GPCRs) are relaying signals only from the plasma membrane have been challenged. It has become clear that some GPCRs can also signal from intracellular compartments and the nucleus. The role and the function of these nuclear GPCRs are subject of intensive investigations. Protease - activated receptors (PAR) are members of the GPCR family. PARs are activated by the cleavage of the N – terminus of the receptor followed by binding of the tethered ligand on to the receptor. Four PARs have been described: PAR1, PAR2, PAR3 and PAR4. PAR2 can induce mitogenic effects and participate in processes such as angiogenesis and inflammation. While many of the intracellular effects of PAR2 can be explained with its plasma membrane signalling pathway, intracrine effects of PAR2 have also been proposed. However the mechanisms by which PAR2 can induce its target gene expressions are still unknown. The purpose of our study was to investigate whether a distinct nuclear population of PAR2 exists. We hypothesized that the roles of PAR2 at different cellular compartments are different since signalling pathways depend on subcellular context. Using confocal microscopy and Western blot techniques we were able to demonstrate the presence of a nuclear population of PAR2. Upon stimulation of the cell membrane PAR2, we observed significant translocation of the receptor from the plasma membrane to the nucleus. Using RT – PCR technique we detected diverse roles of cell surface and nuclear PAR2 on triggered gene expression. In the current study we have attempted to reveal the mechanisms responsible for PAR2 nuclear translocation. We tested the hypothesis that members of the Sorting Nexin (SNX) family are involved in PAR2 nuclear translocation. Sorting Nexins are a new, large group of proteins with well established cargo functions. SNX1 and SNX2 have been demonstrated to be responsible for lysosomal sorting of PAR1. SNX11 has not been studied yet, and we hypothesized that it may be another SNX involved in PAR2 signalling. We developed stable knockdowns for SNX1, SNX2 and SNX11 in HEK293 cells. Using immunofluorescence, Western Blot analysis and FACS assays, we determined that all three members of SNX group are interaction partners of PAR2. However only SNX11 co-localized with its partner in the nucleus and is responsible for its nuclear translocation. RT – PCR experiments on SNXs knockdowns cell lines demonstrated that PAR2 nucleus function is mostly dependent on SNX11; nevertheless SNX1 and SNX2 knockdowns can also attenuate it, suggesting that they are part of PAR2 signalling network. In conclusion, PAR2 is being translocated from the plasma membrane to the nuclear membrane after its stimulation with SLIGKV. PAR2 nucleus translocation triggers intracellular effects different from its cell membrane signalling. SNX11 is the major factor responsible for PAR2 nuclear sorting. Keywords: G – protein coupled receptors, Sorting Nexins, Protease - activated receptors, nuclear translocation, nuclear membrane, nuclear signalling

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Les virus ont besoin d’interagir avec des facteurs cellulaires pour se répliquer et se propager dans les cellules d’hôtes. Une étude de l'interactome des protéines du virus d'hépatite C (VHC) par Germain et al. (2014) a permis d'élucider de nouvelles interactions virus-hôte. L'étude a également démontré que la majorité des facteurs de l'hôte n'avaient pas d'effet sur la réplication du virus. Ces travaux suggèrent que la majorité des protéines ont un rôle dans d'autres processus cellulaires tel que la réponse innée antivirale et ciblées pas le virus dans des mécanismes d'évasion immune. Pour tester cette hypothèse, 132 interactant virus-hôtes ont été sélectionnés et évalués par silençage génique dans un criblage d'ARNi sur la production interferon-beta (IFNB1). Nous avons ainsi observé que les réductions de l'expression de 53 interactants virus-hôte modulent la réponse antivirale innée. Une étude dans les termes de gène d'ontologie (GO) démontre un enrichissement de ces protéines au transport nucléocytoplasmique et au complexe du pore nucléaire. De plus, les gènes associés avec ces termes (CSE1L, KPNB1, RAN, TNPO1 et XPO1) ont été caractérisé comme des interactant de la protéine NS3/4A par Germain et al. (2014), et comme des régulateurs positives de la réponse innée antivirale. Comme le VHC se réplique dans le cytoplasme, nous proposons que ces interactions à des protéines associées avec le noyau confèrent un avantage de réplication et bénéficient au virus en interférant avec des processus cellulaire tel que la réponse innée. Cette réponse innée antivirale requiert la translocation nucléaire des facteurs transcriptionnelles IRF3 et NF-κB p65 pour la production des IFNs de type I. Un essai de microscopie a été développé afin d'évaluer l’effet du silençage de 60 gènes exprimant des protéines associés au complexe du pore nucléaire et au transport nucléocytoplasmique sur la translocation d’IRF3 et NF-κB p65 par un criblage ARNi lors d’une cinétique d'infection virale. En conclusion, l’étude démontre qu’il y a plusieurs protéines qui sont impliqués dans le transport de ces facteurs transcriptionnelles pendant une infection virale et peut affecter la production IFNB1 à différents niveaux de la réponse d'immunité antivirale. L'étude aussi suggère que l'effet de ces facteurs de transport sur la réponse innée est peut être un mécanisme d'évasion par des virus comme VHC. / Viruses interact with cellular factors in order to successfully replicate and propagate in host cells. Germain et al. (2014) performed a proteomics analysis to elucidate viral-host interactors of hepatitis C virus (HCV). They found that the majority of host factors did not have an effect on viral replication, suggesting that these host proteins may be beneficial to the virus by affecting other cellular processes such as evading the innate antiviral immunity. To test that hypothesis, 132 virus-host interactors were selected and silenced by RNAi for their effect on inteferon-beta (IFNB1) production as a readout of the innate antiviral response. 53 were found to modulate the response with enrichment in the gene ontology (GO) terms related to nucleocytoplasmic transport and the nuclear pore complex. An interesting point is that the genes associated with these terms (CSE1L, KPNB1, RAN, TNPO1, and XPO1) were previously elucidated as HCV NS3/4A interactors by Germain et al. (2014), as well as positive regulators of the innate antiviral response. Although it is surprising that a cytoplasmic-replicating virus like HCV would interact with proteins associated with the nucleus, we proposed that viruses interact with these proteins for their benefit to interfere with the innate immune response. The innate antiviral response requires the nuclear translocation of IRF3 and NF-κB p65 for the production of type I interferons. As it is unclear which transporters or nucleoporins are involved, 60 genes associated with the nuclear pore complex and nucleocytoplasmic transport were studied for their effect on the nuclear translocation of IRF3 and NF-κB p65 via a microscopy-based RNAi screen during a 10-hour viral infection time course. Overall, the study revealed that many of these proteins are involved in the trafficking of these transcription factors during a viral infection, and can affect the production of IFNB1 at different levels of the innate antiviral response. The study also suggests that the effect of these transport factors on the immune response may be an evasion mechanism for viruses such as HCV.

Le syndrome néphrotique idiopathique (SNI) se caractérise par un remodelage du cytosquelette des podocytes et par une réorganisation des complexes protéiques podocytaires dont le diaphragme de fente. Récemment, une protéine fondamentale dans le remodelage du cytosquelette a été identifiée au niveau des pédicelles : IQGAP1. Nous sommes partis de l’hypothèse selon laquelle IQGAP1 par ses propriétés et ses caractéristiques biologiques connues dans différents modèles cellulaires (protéine d’échafaudage, remodelage du cytosquelette, migration cellulaire) pourrait être fondamentale dans les modifications ultrastructurales observées au cours du SNI. Au cours de ce travail de thèse, nous avons analysé les caractéristiques de la protéine IQGAP1 dans les podocytes humains, son implication dans les fonctions podocytaires et dans la physiopathologie du SNI. Nous avons dans un premier temps caractérisé les propriétés de la protéine IQGAP1 au sein des podocytes et déterminé sa localisation cellulaire à l’interface entre le cytosquelette et les complexes protéiques apical et diaphragmatique. Nous avons démontré le rôle d’IQGAP1 dans la migration podocytaire et dans la perméabilité de la monocouche épithéliale. Ces phénomènes au cours du SNI étant modifiés, nous avons dans un second temps étudié l’implication d’IQGAP1 dans la physiopathologie du SNI à l’aide de différents modèles expérimentaux (aminonucléoside de puromycine, plasmas de patients présentant un SNI, podocytes mutés pour la PLCε1). Nous avons ainsi démontré la translocation nucléaire de la protéine IQGAP1, dépendante de la voie ERK et de la PLCε1 et son implication dans la survie cellulaire par son interaction avec la chromatine. Au cours du SNI expérimental, nous avons observé une modification des propriétés d’IQGAP1 : localisation, interactions, phosphorylation.Cette approche a permis de démontrer l’implication de la protéine IQGAP1 dans le SNI. Compte tenu de son rôle dans le remodelage du cytosquelette, IQGAP1 pourrait également être un facteur dans la genèse de différentes glomérulopathies. / Idiopathic nephrotic syndrome (INS) is characterized by the pedicel cytoskeleton remodelling and the disruption of the slit diaphragm complex. Recently, a pivotal protein involved in cytoskeleton remodelling has been identified in podocytes: IQGAP1.We hypothesized that IQGAP1 may be crucial in ultrastructure changes observed in INS through its biological properties and characteristics reported in different cell types (scaffold protein, cytoskeleton dynamism, cell migration). Thus, we analysed IQGAP1 characteristics in human podocytes, its involvement in podocyte functions and in the INS pathophysiology. We have characterized IQGAP1 podocyte characteristics and clarified its cell localisation between the cytoskeleton and the apical or diaphragmatic protein complexes Our work demonstrated the role of IQGAP1 in podocyte motility and in the permeability of epithelial monolayer. With respect to the modification of these phenomenons during INS, we have studied IQGAP1 involvement in INS pathophysiology with different experimental models (puromycine aminonucleoside, plasmas from patients suffering from INS, PLCε1 mutated podocytes). We have demonstrated IQGAP1 nuclear translocation, dependant to ERK signaling pathway and to PLCε1 and its involvement in cell survival through its interaction with the chromatin. In the experimental INS, we have observed a modification of IQGAP1 properties: localization, interactions, phosphorylation. This approach allowed us to show IQGAP1 involvement in INS. Through its role in cytoskeleton remodelling, IQGAP1 may be a factor in the development of different glomerulopathies.

Le cancer colorectal (CCR) est la troisième maladie maligne la plus fréquente et la deuxième cause de décès par cancer. La famille des récepteurs tyrosine kinases transmembranaires ErbB a été identifiée comme l'un des principaux moteurs du développement et de la progression du CCR et l'un de ses membres les plus connus, le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR / ERBB1 / Her1), considéré comme l'une des cibles les plus importantes en traitement CRC. Deux autres membres de la famille ErbB, les récepteurs Her2 et Her3, apparaissent également comme de nouvelles cibles importantes pour le CRC en raison de la mutation somatique, de l’amplification génique ou de la résistance aux traitements anti-EGFR. La protéine transmembranaire, Fas (TNFRSF6 / CD95), est un membre de la superfamille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TNFRSF). Il peut transmettre des signaux multiples qui mènent à des destins de cellules complètement différents. Selon les contextes cellulaires, Fas initie la mort cellulaire par apoptose, essentielle pour arrêter les réponses immunitaires chroniques et prévenir l'auto-immunité et le cancer, ou pour stimuler la survie, la prolifération et la motilité des cellules, ce qui favorise l'auto-immunité, la croissance cancéreuse et les métastases. Avec des preuves de plus en plus nombreuses de la signalisation pro-survie médiée par Fas, les activités de promotion du cancer chez les patients atteints de cancer sont maintenant reconnues comme étant significatives et cliniquement pertinentes. Bien que cette polyvalence de signalisation ait été particulièrement bien démontrée dans le cancer du côlon, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les voies de survie sont encore largement inconnus. Dans ce contexte, l'objectif principal de mon doctorat Le projet visait à étudier l’importance du crosstalks entre les membres de la famille Fas et ErbB et, plus particulièrement, à déterminer si la signalisation Fas pouvait influencer la signalisation de l’EGFR favorisant le cancer.Plus précisément, je décris comment l’état de phosphorylation de la tyrosine Fas influence fortement la signalisation de la voie EGFR dans les cellules colorectales. Mes données démontrent que Fas dans son état prosurvival, phosphorylé à Y291 (pY291-Fas), interagit en effet avec EGFR et que cette interaction intensifie significativement la signalisation de l'EGFR dans les cellules cancéreuses colorectales anti-EGFR via la voie Yes-1 / STAT3. Le pY291-Fas s'accumule dans le noyau lors du traitement par EGF et favorise la localisation nucléaire du phospho-EGFR et du phospho-STAT3, l'expression de la cycline D1, l'activation des voies Akt et MAPK médiées par STAT3 et enfin la prolifération et la migration cellulaires. De plus, je découvre également le rôle potentiel que Her3 pourrait jouer avec Fas dans la libération des cellules cancéreuses colorectales de l'inhibition anti-EGFR.Tous ensemble mon doctorat des études permet de mieux comprendre le rôle des voies de survie de Fas dans la signalisation ErBb dans le CRC. Fait important, en démontrant un lien entre l'émergence d'une résistance aux traitements anti-ErbB et le signal de Fas pro-survie, mon travail justifie le développement d'une thérapie ciblée Fas / phospho-Fas comme nouvelle option thérapeutique pour surmonter les anti-EGFR, chez les patients présentant une résistance anti-EGFR secondaire. / Colorectal cancer (CRC) is the third most common malignant disease and the second most frequent cause of cancer-related death. The ErbB family of transmembrane receptor tyrosine kinases has been identified as a major driver of the development and progression of CRC and one its best-known member, the epidermal growth factor receptor (EGFR /ERBB1/Her1), considered one of the most important targets in CRC treatment. Two others members of the ErbB family, the receptors Her2 and Her3, also emerge as important new targets for CRC due to the somatic mutation, gene amplification or resistance to the anti-EGFR therapies. The transmembrane protein, Fas (TNFRSF6/CD95), is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF). It can transmit multiple signals that lead to completely different cell fates. Depending on cellular contexts, Fas either initiates cell death by apoptosis, which is essential for shutting down chronic immune responses and preventing autoimmunity and cancer, or stimulates cell survival, proliferation, and motility, which can promote autoimmunity, cancer growth, and metastasis. With increasing evidence of Fas-mediated pro-survival signaling, the cancer-promoting activities of Fas are now recognized as significant and clinically relevant. While this signaling versatility has been particularly well demonstrated in colon cancer, the molecular mechanisms underlying the survivals pathways are still largely unknown. In this context, the main aim of my Ph.D. project was to study the importance of the crosstalks between Fas and the ErbB family members and more specifically to determine whether the Fas signaling could influence the cancer-promoting signaling of EGFR.More precisely, I describe how the Fas tyrosine phosphorylation status strongly influences the signaling of the EGFR pathway in colorectal cells. My data demonstrate that Fas in its prosurvival state, phosphorylated at Y291 (pY291-Fas), indeed interacts with EGFR and that this interaction significantly intensifies EGFR signaling in anti-EGFR-resistant colorectal cancer cells via the Yes-1/STAT3-mediated pathway. The pY291-Fas accumulates in the nucleus upon EGF treatment and promotes the nuclear localization of phospho-EGFR and phospho-STAT3, the expression of cyclin D1, the activation of STAT3-mediated Akt and MAPK pathways, and finally the cell proliferation and migration. Additionally, I also uncover the potential role that Her3, may play along with Fas, in the colorectal cancer cell escape from anti-EGFR inhibition. All together my Ph.D. studies provide a better understanding of the role of the Fas survival pathways in the ErBb signaling in CRC. Importantly, by demonstrating a connection between the emergence of resistance to anti-ErbB therapies and the Fas pro-survival signal, my work provides a rationale for the development of Fas/phospho-Fas targeted therapy as a new therapeutic option for overcoming anti-EGFR, in patients with secondary anti-EGFR resistance.