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Les variations de la concentration cytosolique de Ca[indice supérieur 2+] contrôlent divers processus biologiques tel la contraction, la division cellulaire et la transactivation de gènes. Chez les cellules non excitables, la stimulation de certains GPCRs (G protein coupled receptor) ou récepteurs tyrosine kinase mène à l'activation d'une phospholipase C qui produit de l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3]). L'IP[indice inférieur 3] active un récepteur-canal au niveau du réticulum endoplasmique (RE) et permet une relâche de Ca[indice supérieur 2+] du RE. Il existe trois isoformes distinctes d'IP[indice inférieur 3]R (IP[indice inférieur 3]R-1 à -3) différemment exprimées dans les tissus. Dans ces travaux, nous avons étudié un mode de régulation de l'IP[indice inférieur 3]R-2 par la PKC, une kinase elle-même activée lors de la réponse calcique. Nous avons aussi vérifié l'implication de chaque isoforme d'IP[indice inférieur 3]R dans l'activité transcriptionnelle des facteurs de transcription sensibles au Ca[indice supérieur 2+] NFAT et CREB.Les cellules AR4-2J expriment principalement l'IP[indice inférieur 3]R-2 (86%), ce qui en fait un bon modèle d'étude pour les mécanismes de régulation de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Dans la première étude, nous avons vérifié si la PKC influençait l'activité calcique de l'IP[indice inférieur 3]R-2. D'abord, nous avons montré que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est majoritairement exprimé dans les cellules AR4-2J. Nous avons montré par phosphorylation in vitro et in cellulo que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est phosphorylé par la PKC. Nous avons montré que le traitement par la PKC réduit la réponse calcique induite par l'IP[indice inférieur 3] sur des cellules perméabilisées. Finalement, nous avons démontré que la réponse calcique induite par le CCh ou l'EGF sur des cellules entières était réduite avec l'activation de la PKC. Ces résultats indiquent que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est une autre cible de la PKC permettant de contrôler l'intensité de la réponse calcique. Dans la deuxième étude l'objectif était de déterminer l'implication des isoformes d'IP[indice inférieur 3]R sur l'activité des facteurs de transcription sensibles au Ca[indice supérieur 2+] NFAT et CREB. Par l'approche des gènes rapporteurs de l'activité de NFAT ou CREB, nous avons montré que NFAT était activé par la voie de la calcineurine et que CREB par les voies de CamKII et de la calcineurine dans les cellules HEK 293A. Nous avons démontré que l'invalidation de l'IP[indice inférieur 3]R-2 diminuait la réponse calcique induite par le CCh et que la costimulation avec le VIP pouvait la restaurer. Nous avons montré que l'activité transcriptionnelle de NFAT était affectée, contrairement à celle de CREB, par l'invalidation de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Finalement, nous avons montré que l'IP[indice inférieur 3]R-2, et aussi l'IP[indice inférieur 3]R-1, semblent jouer un rôle secondaire, différent de celui de transporteur de Ca[indice supérieur 2+], dans le mécanisme d'activation de NFAT. Ces résultats laissent envisager que l'IP[indice inférieur 3]R serait impliqué dans la formation d'un complexe protéique facilitant l'activation de NFAT.

Le récepteur de l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP?R), un canal calcique, est un des principaux régulateurs de la mobilisation de Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire. En regardant globalement les mécanismes de régulation des IP?Rs, on peut se rendre compte que cette régulation se fait bien souvent dans le contexte précis d'une ou de plusieurs voies de signalisation. Bien que de nombreux modulateurs de l'activité calcique des IP?Rs soient déjà connus, encore aujourd'hui beaucoup de questions sont en suspens. En fait, un nombre croissant de preuves et d'observations suggèrent que la régulation spécifique des mécanismes de signalisation calcique peut être accomplie par l'activation simultanée de plusieurs voies de signalisation ce qui permet de soutenir la diversité d’action du Ca[indice supérieur 2+]. Une de ces voies, la voie de croissance et de prolifération cellulaire PI3K-AKT-mTOR fut d’abord investiguée dans la première partie de cette thèse afin de comprendre l’importance de l’activité calcique des IP?R dans ces phénomènes d’importance majeure. Nous avons montré que mTOR interagit et phosphoryle l'IP?R-3 dans les cellules RINm5F puis déterminé que le niveau d’activité de mTOR affectait les relâches calciques médiées par l'IP?R-3 de ces cellules. Sachant que mTOR contrôle la prolifération et l'homéostasie cellulaire et que le Ca[indice supérieur 2+] joue aussi un rôle clé dans ces deux phénomènes, il est logique de croire que mTOR facilite les relâches calciques dépendantes des IP?Rs afin de fournir le Ca[indice supérieur 2+] nécessaire aux actions physiologiques de mTOR. La deuxième section de cette thèse a exploré l’interaction entre la voie dopaminergique et la voie calcique dépendante des IP?Rs. Nos résultats suggèrent que calcyon, une protéine liant le Ca [indice supérieur 2+] surexprimée dans plusieurs neuropathologies, est impliquée dans l'internalisation des récepteurs D2 par un mécanisme encore inconnu qui cause par le fait même une relâche calcique tardive dans les cellules PC-12. Nous avons montré que cette protéine affecte aussi l’activité calcique des IP?Rs. Nos résultats suggèrent que calcyon est la protéine reliant les voies de signalisation calcique et dopaminergique et que son implication est d’importance majeure afin d’assurer l’homéostasie calcique neuronale. L’ensemble de ces travaux montre toute l’étendue de la régulation calcique et de l’interaction entre les voies de signalisation.

Le récepteur à l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3]R) est un canal calcique jouant un rôle prépondérant dans le contrôle du calcium à l'intérieur des cellules non-excitables. Il existe trois sous-types d'IP[indice inférieur 3]R qui sont encodés par des gènes différents. L'objectif de mon travail était d'évaluer la régulation des IP[indice inférieur 3]Rs par différents mécanismes extrinsèque et intrinsèque. Avec une approche in vitro , nous avons montré que l'IP[indice inférieur 3]R-3 est un substrat de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA). Avec une approche de"backphosphorylation", nous avons également montré que la PKA phosphoryle de manière endogène l'IP[indice inférieur 3]R-3 dans les cellules RINm5F intactes. Avec des études de liaison, nous avons montré que la PKA augmente l'affinité de l'IP[indice inférieur 3]R-3. La mesure des relâches de Ca[indice supérieur 2+] induites par l'IP[indice inférieur 3] sur des cellules perméabilisées a aussi révélé que la PKA augmente l'affinité apparente de l'IP[indice inférieur 3]R-3. Enfin, dans des cellules RINm5F intactes, la PKA a potentié la relâche de Ca[indice supérieur 2+] induite par le carbachol et le facteur de croissance épidermique, deux agonistes qui activent la phospholipases C par des mécanismes différents. Ces résultats ont révélé une étape de convergence où la voie de signalisation de l'AMPc et la voie de signalisation du Ca[indice supérieur 2+] interagissent pour moduler différentes fonctions au sein d'une seule et même cellule face à des stimuli externes. Les différents domaines des IP[indice inférieur 3]Rs ont des rôles particuliers dans le contrôle fin de l'homéostasie calcique intracellulaire. Nous avons montré qu'un mutant tronqué de l'IP[indice inférieur 3]R-2 (CTR2), qui ne comporte que les 2 derniers domaines transmembranaires et la queue C-terminale, se comporte comme un canal calcique constitutivement actif. Les cellules exprimant le CTR2 ont moins de Ca[indice supérieur 2+] dans leurs réserves intracellulaire [sic], relâchent moins de Ca[indice supérieur 2+] en réponse aux agonistes et montrent une entrée capacitative de Ca[indice supérieur 2+] en conditions basales. Ces résultats suggèrent qu'en absence d'une régulation intrinsèque par sa portion N-terminale, l'IP[indice inférieur 3]R-2 se comporte comme un canal calcique ouvert. L'ensemble de mon travail met en évidence un mécanisme extrinsèque (PKA) et un mécanisme intrinsèque (N-terminal) de régulation de l'activité des IP[indice inférieur 3]Rs.

Phosphatidyl D-myo-inositol (3,4,5)-trisphosphate [PtdIns(3,4,5)P3] contributes to the activation of protein kinase B (PKB) by interacting with the PKB PH domain. PKB is known to be up-regulated in several cancer cell types. Compounds that can display selective inhibition of this kinase have promising chemotherapeutic potential, and inhibition of the PH domain of PKB represents a realistic means by which to achieve this. Analysis of the X-ray crystal structures of apo PKBαPH and PKBαPH bound to D-myo-inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate [InsP4, the inositol head group of PtdIns(3,4,5)P3] led to the design of PtdIns(3,4,5)P3 and InsP4 analogues as potential PKB PH domain inhibitors. The synthesis of PtdIns(3,4,5)P3 analogues modified at the C-4 position was investigated, but it was discovered that such compounds were prone to migration of the 1-position phosphate. Subsequently, a range of racemic InsP4 analogues, modified at the C-1 or C-4 position, were successfully synthesised. Advanced progress has also been made towards the synthesis of enantiomerically pure analogues of InsP4.

Le récepteur de l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3]R) est un canal calcique qui joue un rôle majeur dans la régulation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire. Il existe trois sous-types d'IP[indice inférieur 3]R. Peu d'information est disponible sur les propriétés de l'IP[indice inférieur 3]R-2 et de l'IP[indice inférieur 3]R-3. De plus, la régulation spécifique du mécanisme de signalisation calcique peut être accomplie par l'activation simultanée de plusieurs voies de signalisation. Les kinases intervenant lors de l'activation concomitante de la voie de production de l'AMPc et des voies prolifératives sont susceptibles de réguler les IP[indice inférieur 3]R. Ainsi, l'objectif de ma thèse fut de caractériser l'effet de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA) et de la cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) sur l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2. La première partie de ma thèse consista à étudier l'effet possible de la PKA sur l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2 dans les cellules AR4-2J, une lignée cellulaire exprimant principalement l'IP[indice inférieur 3]R-2. Nous avons d'abord démontré que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est un bon substrat de la PKA. Qui plus est, des essais calciques réalisés sur des cellules AR4-2J perméabilisées suggèrent que la PKA augmente l'affinité apparente de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Enfin, la stimulation de la production d'AMPc entraîne une augmentation des relâches calciques dans les cellules AR4-2J intactes. Ces résultats suggèrent donc que la PKA augmente l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Dans la seconde partie de cette thèse, nous démontrons que la kinase mTOR, point de convergence des voies prolifératives, phosphoryle l'IP[indice inférieur 3]R-2 dans les cellules AR4-2J. Les essais calciques réalisés sur des cellules AR4-2J perméabilisées suggèrent également que mTOR augmente l'affinité apparente de l'IP[indice inférieur 3]R-2. De surcroît, la rapamycine (un inhibiteur de mTOR) réduit les relâches calciques induites par le carbachol dans les cellules AR4-2J et dans les cellules HEK 293A exprimant presque exclusivement l'IP[indice inférieur 3]R-2. Ces résultats suggèrent donc que mTOR augmente l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2. L'ensemble de ces travaux approfondit notre compréhension des mécanismes par lesquels les signaux calciques sont finement régulés dans les cellules.

Lors de l'activation de l'apoptose, une multitude de protéines sont clivées. Parmi celles-ci, on retrouve le récepteur à l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3] R) qui est clivé par la caspase-3 au niveau du domaine de régulation, tout juste avant le domaine du pore calcique. L'IP[indice inférieur 3] R est un récepteur-canal situé à la membrane du réticulum endoplasmique et joue un rôle crucial dans la régulation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire. Le fragment issu du clivage par la caspase-3 aurait la particularité de créer des canaux calciques constitutivement actifs. La présence de ces canaux provoquerait un débalancement dans l'homéostasie calcique, essentielle à la survie et au maintien de la cellule. En dirigeant l'expression de ce fragment dans des cellules ciblées, tel que les cellules cancéreuses, la perturbation de l'homéostasie calcique pourrait être suffisamment importante pour activer les voies apoptotiques. Nous avons voulu caractériser le débalancement calcique provoqué par le fragment du récepteur à l'IP[indice inférieur 3] (CTR). Pour ce faire, nous avons créé les fragments CTR1 et CTR2, correspondant aux formes de l'IP[indice inférieur 3] R-1 et de l'IP[indice inférieur 3] R-2, respectivement, tronqués au début du domaine canal. Nous avons montré l'expression du CTR1 et du CTR2 au niveau du réticulum endoplasmique ainsi que leur capacité à former des homo- et hétérodimères avec d'autres CTRs et avec les IP [indice inférieur 3] Rs endogènes de la cellule. L'évaluation du contenu calcique du réticulum endoplasmique a révélé que les CTR1 et CTR2 forment des canaux calciques constitutivement actifs, mais que leur impact sur l'homéostasie calcique ne semble pas affecter la cellule. Ces résultats montrent donc que les CTR1 et CTR2 ne sont pas des bons candidats pour moduler les niveaux calciques du réticulum endoplasmique.

The release of chemical transmitter from nerve terminals is critically dependent on a transient increase in intracellular Ca2+.6,25 The increase in Ca2+ may be due to influx of Ca2+ from the extracellular fluid15 or release of Ca2+ from intracellular stores such as mitochondria.1,8,18 Whether Ca2+ utilized in transmitter release is liberated from organelles other than mitochondria is uncertain. Smooth endoplasmic reticulum is known to release Ca2+, e.g., on activation by inositol trisphosphate or cyclic adenosine diphosphate-ribose,2 so the possibility exists that Ca2+ from this source may be involved in the events leading to exocytosis. We examined this hypothesis by testing whether inositol trisphosphate and cyclic adenosine diphosphate-ribose modified transmitter release. We used liposomes to deliver these agents into the cytoplasmic compartment and binomial analysis to determine their effects on the quantal components of transmitter release. Administration of inositol trisphosphate (10-4M) caused a rapid, 25% increase in the number of quanta released. This was due to an increase in the number of functional release sites, as the other quantal parameters were unaffected. The effect was reversed with 40min of wash. Virtually identical results were obtained with cyclic adenosine diphosphate-ribose (10-4M). Inositol trisphosphate caused a 10% increase in quantal size, whereas cyclic adenosine diphosphate-ribose had no effect. The results suggest that quantal transmitter release can be increased by Ca2+ released from smooth endoplasmic reticulum upon stimulation by inositol trisphosphate or cyclic adenosine diphosphate-ribose. This may involve priming of synaptic vesicles at the release sites or mobilization of vesicles to the active zone. Inositol trisphosphate may have an additional action to increase the content of transmitter within the vesicles. These findings raise the possibility of a role of endogenous inositol phosphate and smooth endoplasmic reticulum in the regulation of cytoplasmic Ca2+ and transmitter release.

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