L'apoptose est le processus principal d'autodestruction d'une cellule en réponse à divers stimuli. Cette forme de mort cellulaire, conservée à travers l'évolution est nécessaire au développement embryonnaire, à l'éducation du système immunitaire et à l'homéostasie des organismes pluricellulaires. Ce processus est débalancé dans plusieurs pathologies prolifératives et dégénératives. Durant l'apoptose, un groupe de protéases à cystéine nommées caspases jouent [joue] un rôle essentiel dans l'exécution du signal de mort cellulaire. Ces enzymes clivent une multitude de substrats dans des cascades d'activation menant au démantèlement de la cellule. Un de ces substrats est le récepteur de l'inositol 1,4,5-trisphosphate de type 1 (IP[indice inférieur 3]R-1). Il s'agit d'un canal calcique intracellulaire situé sur la membrane du réticulum endoplasmique jouant un rôle primordial dans la régulation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire. Le clivage de l'IP[indice inférieur 3]R-1 perturberait ainsi l'homéostasie calcique, essentielle à la survie de la cellule. Afin d'étudier l'importance du clivage de l'IP[indice inférieur 3]R-1 par la caspase-3 dans le processus de l'apoptose, des mutants du récepteur ont été générés et leurs propriétés ont été comparées à celles du récepteur de type sauvage. Le site de reconnaissance par les caspases (DEVD[flèche vers le bas]R) a été aboli dans les mutants IEVA[flèche vers le bas]R et DEVA[flèche vers le bas]R, alors qu'une courte séquence (ENLYFQ[flèche vers le bas]S) reconnue par la protéase TEV du virus de la mosaïque du tabac a été introduite dans un troisième mutant qui ne peut être clivé par les caspases (DEVA[flèche vers le bas]R). Avec ces mutants, nous avons obtenu des résultats qui confirment que l'IP[indice inférieur 3]R-1 est clivable par la caspase-3 (et aussi par la caspase-7), mais sous des conditions extrêmes (en présence de plus de dix fois le niveau physiologique des caspases). Par contre, le clivage de l'IP[indice inférieur 3]R-1 ne se produit pas in cellulo, dans des conditions apoptotiques normales où la caspase 3 est activée. Ces résultats suggèrent que l'IP[indice inférieur 3]R-1 n'est pas un bon substrat de la caspase 3, parce que son clivage n'est pas efficace, et surtout parce qu'il n'a pas lieu à chaque fois que la mort cellulaire par apoptose est induite. Ces résultats montrent que l'IP[indice inférieur 3]R-1 ne possède pas le profil d'un substrat de caspase dont le clivage est fondamental pour le bon déroulement de l'apoptose.

L'endothélium constitue un véritable organe qui sécrète de nombreuses substances vasoactives régissant des fonctions cardiovasculaires vitales telles que le tonus et la croissance vasculaires. Ce tissu requiert la polyvalence de la signalisation calcique puisque plusieurs de ses fonctions dépendent de la modulation de la concentration intracellulaire de Ca[indice supérieur 2+].L'un des moyens utilisés par les cellules endothéliales pour assurer une réponse calcique efficace et spécifique est la propagation des signaux sous forme de vagues. Dans ce travail, nous avons décortiqué les mécanismes de mobilisation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire menant à la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+]. Nous avons recueilli des données qui aideront à mieux comprendre à la fois l'organisation et la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+] dans les cellules endothéliales d'aorte de boeuf (BAEC). Nous montrons par vidéomicroscopie, que la stimulation des BAEC avec l'ATP ou avec la bradykinine (BIC) induit une réponse calcique oscillatoire finement régulée dans le temps et dans l'espace. En fait, le Ca[indice supérieur 2+] se propage d'une extrémité à l'autre de la cellule sous la forme d'une vague qui se produit en présence ou en absence de Ca[indice supérieur 2+] extracellulaire. Bien que les vagues de Ca[indice supérieur 2+] soient initiées à un endroit très précis près de la membrane plasmique, les cavéoles ne sont pas essentielles à leur propagation dans les BAEC, contrairement à ce qui a été observé dans certains autres types cellulaires. Toutefois, la dépolymérisation des microfilaments avec la latrunculine B et des microtubules avec la colchicine empêche la propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+]. Dans ces conditions, les BAEC présentent plutôt une augmentation calcique uniforme dans toute la cellule. Ces résultats suggèrent que, dans les BAEC, les cavéoles ne sont pas impliquées dans l'organisation de la réponse calcique sous forme de vague, mais que l'organisation du cytosquelette est essentielle. Nous montrons aussi que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] est constante d'un bout à l'autre d'une BAEC, ce qui est incompatible avec un mécanisme impliquant uniquement la diffusion de l'IP[indice inférieur 3] ou du Ca[indice supérieur 2+]. Nous montrons également que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] dépend de l'intensité de la stimulation et aussi de l'état fonctionnel de l'IP[indice inférieur 3]R qui peut être modulé par des kinases endogènes comme la PKA, la PKC et mTOR. Enfin, nous montrons que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] n'est pas directement reliée à l'amplitude de la relâche de Ca[indice supérieur 2+]. La vitesse de propagation des vagues de Ca[indice supérieur 2+] est un paramètre relativement nouveau dans le domaine de la signalisation calcique intracellulaire. Il reste à définir jusqu'à quel point ce paramètre peut être utile dans l'interprétation des différentes activités cellulaires.

Lors de l'activation de l'apoptose, une multitude de protéines sont clivées. Parmi celles-ci, on retrouve le récepteur à l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3] R) qui est clivé par la caspase-3 au niveau du domaine de régulation, tout juste avant le domaine du pore calcique. L'IP[indice inférieur 3] R est un récepteur-canal situé à la membrane du réticulum endoplasmique et joue un rôle crucial dans la régulation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire. Le fragment issu du clivage par la caspase-3 aurait la particularité de créer des canaux calciques constitutivement actifs. La présence de ces canaux provoquerait un débalancement dans l'homéostasie calcique, essentielle à la survie et au maintien de la cellule. En dirigeant l'expression de ce fragment dans des cellules ciblées, tel que les cellules cancéreuses, la perturbation de l'homéostasie calcique pourrait être suffisamment importante pour activer les voies apoptotiques. Nous avons voulu caractériser le débalancement calcique provoqué par le fragment du récepteur à l'IP[indice inférieur 3] (CTR). Pour ce faire, nous avons créé les fragments CTR1 et CTR2, correspondant aux formes de l'IP[indice inférieur 3] R-1 et de l'IP[indice inférieur 3] R-2, respectivement, tronqués au début du domaine canal. Nous avons montré l'expression du CTR1 et du CTR2 au niveau du réticulum endoplasmique ainsi que leur capacité à former des homo- et hétérodimères avec d'autres CTRs et avec les IP [indice inférieur 3] Rs endogènes de la cellule. L'évaluation du contenu calcique du réticulum endoplasmique a révélé que les CTR1 et CTR2 forment des canaux calciques constitutivement actifs, mais que leur impact sur l'homéostasie calcique ne semble pas affecter la cellule. Ces résultats montrent donc que les CTR1 et CTR2 ne sont pas des bons candidats pour moduler les niveaux calciques du réticulum endoplasmique.

L'endothélium est la monocouche de cellules qui tapissent la paroi interne des vaisseaux sanguins. Ce tissu a besoin de la polyvalence de la signalisation calcique puisque plusieurs de ses fonctions dépendent de la mobilisation de Ca2+. La mobilisation du Ca2+ intracellulaire dans les cellules non-excitables est majoritairement sous le contrôle du récepteur à l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 R). Les Stromal Interaction Molecules (STIM1 et STIM2) sont des protéines membranaires exprimées sur le réticulum endoplasmique (RE) qui ont la capacité de détecter le niveau de Ca2+ dans le RE. Elles activent le canal plasmique Orai suite à la diminution du niveau de Ca2+ dans le RE. Puisque STIM1 et STIM2 sont des senseurs de Ca2+ du RE, notre hypothèse est qu'elles peuvent aussi réguler la relâche calcique quantale de l'IP3 R, puisque les niveaux de Ca2+ du RE sont importants dans la régulation de la relâche calcique quantale de l'IP3 R. Nous avons montré que les IP3 Rs et les STIMs sont présents dans les cellules endothéliales d'aorte bovine (BAEC) et avec une approche de co-immunoprécipitation, nous avons observé que STIM1 et STIM2 interagissent avec les IP3 Rs. A l'aide d'une approche de vidéomicroscopie par fluorescence, il a été possible de déterminer l'impact de STIM sur la relâche de Ca2+ par l'IP3 R. Dans les BAEC, l'ATP et la bradykinine (BK), via leurs récepteurs respectifs P2 Y et B2, activent la production d'IP3 et ainsi la relâche de Ca2+ par l'IP3 R. Lors de stimulations avec différentes concentrations d'ATP et de BK, la relâche de Ca2+ a été significativement réduite dans les cellules où l'expression de STIM1 a été atténuée. Par contre chez les cellules où l'expression de STIM2 a été atténuée, il n'y a pas eu de changement notable dans la relâche de Ca 2+. Les courbes concentration-réponse ont montré qu'il n'y a pas de changement significatif dans les valeurs d'EC50 obtenues dans les conditions où l'expression de STIM1 ou STIM2 est atténuée. Ces résultats montrent que STIM n'est pas le senseur calcique impliqué dans la relâche calcique quantale de l'IP 3 R. Nos résultats suggèrent plutôt que STIM1, et non STIM2, est un potentiateur de l'activité canal de l'IP3 R. [symboles non conformes]

Le Ca[indice supérieur 2+] joue un rôle primordial dans plusieurs processus physiologiques comme la contraction, la sécrétion, la croissance et la prolifération cellulaire et même l’apoptose. Ainsi, une régulation adéquate des niveaux de Ca[indice supérieur 2+] dans la cellule est essentielle à son bon fonctionnement. Plusieurs protéines-clés sont impliquées dans cette homéostasie calcique. Cette étude a permis d’identifier deux mécanismes distincts responsables de friner la signalisation calcique dans un modèle de cellules non-excitables et dans un modèle de cellules excitables, en mettant l’emphase sur la régulation des canaux calciques par leur interaction avec des protéines clés. Le premier mécanisme implique la régulation du récepteur à l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3]R) par la protéine chaperonne Hsp90 dans les cellules HEK293T. J’ai montré que Hsp90 interagit avec l'IP[indice inférieur 3]R dans le but de diminuer son activité. De plus, cette interaction dépend de la voie de signalisation de l’insuline, plus particulièrement des protéines kinases mTOR et Src, qui sont impliquées dans cette interaction. Ainsi, l’interaction entre Hsp90 et l'IP[indice inférieur 3]R fait partie d’un mécanisme de rétroaction négative de la voie de signalisation de l’insuline. Le second mécanisme implique la régulation des canaux calciques dépendants du voltage de type T (T-VDCC) par la protéine STIM1 dans les cardiomyocytes HL-1. J'ai montré que STIM1, qui est le principal senseur de Ca[indice supérieur 2+] du réticulum sarco/endoplasmique, interagit avec les T-VDCC afin de diminuer leur expression à la membrane cellulaire et ainsi atténuer leur activité. Cette interaction permet de prévenir une entrée excessive de Ca[indice supérieur 2+] dans la cellule menant à une surcharge de Ca[indice supérieur 2+] dans le réticulum sarcoplasmique et, par le fait même, à des événements arythmiques associés à la surcharge. Bien que ces deux études aient été effectuées dans des environnements différents, soit un modèle de cellules non-excitables et un modèle de cellules excitables, elles mettent en évidence deux mécanismes pouvant friner la signalisation calcique dans le but d’assurer une fonction normale à la cellule.

Le récepteur à l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3]R) est un canal calcique jouant un rôle prépondérant dans le contrôle du calcium à l'intérieur des cellules non-excitables. Il existe trois sous-types d'IP[indice inférieur 3]R qui sont encodés par des gènes différents. L'objectif de mon travail était d'évaluer la régulation des IP[indice inférieur 3]Rs par différents mécanismes extrinsèque et intrinsèque. Avec une approche in vitro , nous avons montré que l'IP[indice inférieur 3]R-3 est un substrat de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA). Avec une approche de"backphosphorylation", nous avons également montré que la PKA phosphoryle de manière endogène l'IP[indice inférieur 3]R-3 dans les cellules RINm5F intactes. Avec des études de liaison, nous avons montré que la PKA augmente l'affinité de l'IP[indice inférieur 3]R-3. La mesure des relâches de Ca[indice supérieur 2+] induites par l'IP[indice inférieur 3] sur des cellules perméabilisées a aussi révélé que la PKA augmente l'affinité apparente de l'IP[indice inférieur 3]R-3. Enfin, dans des cellules RINm5F intactes, la PKA a potentié la relâche de Ca[indice supérieur 2+] induite par le carbachol et le facteur de croissance épidermique, deux agonistes qui activent la phospholipases C par des mécanismes différents. Ces résultats ont révélé une étape de convergence où la voie de signalisation de l'AMPc et la voie de signalisation du Ca[indice supérieur 2+] interagissent pour moduler différentes fonctions au sein d'une seule et même cellule face à des stimuli externes. Les différents domaines des IP[indice inférieur 3]Rs ont des rôles particuliers dans le contrôle fin de l'homéostasie calcique intracellulaire. Nous avons montré qu'un mutant tronqué de l'IP[indice inférieur 3]R-2 (CTR2), qui ne comporte que les 2 derniers domaines transmembranaires et la queue C-terminale, se comporte comme un canal calcique constitutivement actif. Les cellules exprimant le CTR2 ont moins de Ca[indice supérieur 2+] dans leurs réserves intracellulaire [sic], relâchent moins de Ca[indice supérieur 2+] en réponse aux agonistes et montrent une entrée capacitative de Ca[indice supérieur 2+] en conditions basales. Ces résultats suggèrent qu'en absence d'une régulation intrinsèque par sa portion N-terminale, l'IP[indice inférieur 3]R-2 se comporte comme un canal calcique ouvert. L'ensemble de mon travail met en évidence un mécanisme extrinsèque (PKA) et un mécanisme intrinsèque (N-terminal) de régulation de l'activité des IP[indice inférieur 3]Rs.