La voie ERK/MAPK est impliquée dans plusieurs processus biologiques dont la prolifération cellulaire, la différenciation, l'apoptose et la migration. Les protéines kinases MEK1 et MEK2 sont les seuls activateurs connus d'ERKl et ERK2. Les mutations inactivant les gènes Mekl et Mek2 ont été développées chez la souris pour étudier les fonctions des ces deux activateurs lors du développement embryonnaire. L'analyse phénotypique des mutants Mekl" montre une diminution de la prolifération et une augmentation de l'apoptose des populations trophoblastiques. Les embryons Mekïf~ meurent à mi-gestation d'une sous-vascularisation du labyrinthe placentaire qui normalement permet les échanges gazeux et nutritiormels foeto-maternels. Des analyses histologiques suggèrent également un problème de migration lors des processus d'invagination du réseau vasculaire. Ces résultats montrent que MEK1 est impliqué spécifiquement dans certaines fonctions des trophoblastes et que son absence induit une dysmorphogénèse létale du placenta murin. Pour étudier l'implication spécifique de MEK1 dans ces populations trophoblastiques, des modèles cellulaires ont été établis.

Le placenta assure les échanges materno-fœtaux et possède une fonction endocrine autonome. Les hormones placentaire lactogène (hPL) et chorionique gonadotrope (hCG) sont synthétisées par le syncytiotrophoblaste. A ce jour, les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion de ces deux hormones ne sont pas connus. In vitro, l’influx d’ions Ca2+ entraîne une augmentation immédiate et soutenue de la libération d’hPL et d’hCG à partir d’explants de placentas à terme. En outre, l’élévation de la concentration extracellulaire en albumine, principale protéine maternelle circulante en contact direct avec le trophoblaste, stimule de manière immédiate et transitoire la libération d’hPL et d’hCG.<p><p>L’objectif de nos travaux a été de vérifier la spécificité de l’activité sécrétagogue de l’albumine au niveau du placenta, de caractériser les messagers cellulaires potentiellement impliqués dans la libération d’hPL et d’hCG, et de définir l’interaction entre l’albumine et le trophoblaste, en utilisant des explants provenant de placentas humains à terme.<p> <p>Nos travaux démontrent que la riposte sécrétoire à l’albumine (5%, m/v) est largement mimée par d’autres agents colloïdaux (dextran et polygéline). Cette stimulation colloïdale de la libération d’hPL et d’hCG impliquerait une mobilisation de Ca2+ à partir de réserves intracellulaires. L’intervention de 3 messagers cellulaires a été envisagée: les IPs/DAG, l’AMPc, et le GMPc. Le fluorure de sodium, la forskoline, ou le nitroprussiate sodique, activateurs connus de la production respective des IPs, de l’AMPc, et du GMPc, augmentent de manière significative les taux placentaires de chacun de ces messagers, sans toutefois affecter la libération d’hPL ou d’hCG. De plus, l’élévation de la concentration extracellulaire en albumine (5%, m/v) ne modifie pas les taux des IPs, de l’AMPc et du GMPc dans les explants placentaires, tandis qu’elle stimule la sécrétion hormonale. Ces systèmes de signalisation, bien que fonctionnels au niveau du trophoblaste, ne joueraient donc pas un rôle majeur dans la régulation de la libération d’hPL et d’hCG. <p><p>Nos résultats mettent en évidence une internalisation rapide d’albumine marquée, avec de l’125I ou de la fluorescéïne, dans le syncytiotrophoblaste. Une large fraction de cette albumine est recyclée, intacte, vers la circulation maternelle selon un processus sensible à l’abaissement de la température et indépendant du cytosquelette. L’albumine marquée restant dans les explants placentaires est partiellement dégradée. Trois mécanismes ont été envisagés pour expliquer ces mouvements d’entrée et de sortie de l’albumine au sein du placenta humain: l’endocytose médiée par l’albondine via les caveolae, le système des coated pits clathrine-dépendant, et l’endocytose médiée par la mégaline. Par immunohistochimie, nous avons montré que, dans le tissu placentaire, la caveoline-1, protéine caractéristique des caveolae, est localisée uniquement dans l’endothelium des capillaires fœtaux. La clathrine, au niveau des coated pits, et la mégaline se trouvent au contraire dans le syncytiotrophoblaste. La méthyl-b-cyclodextrine et l’hydrochlorure de chlorpromazine, inhibiteurs d’une endocytose dépendant de la clathrine, réduisent significativement l’internalisation placentaire de l’albumine marquée. Par contre, le DIDS ou le NPPB, susceptibles de perturber l’endocytose médiée par la mégaline, n’affectent pas la captation d’albumine marquée par les explants placentaires. L’albumine pénétrerait donc dans le syncytiotrophoblaste principalement par un processus clathrine-dépendant. La mégaline ne jouerait ici qu’un rôle mineur dans l’entrée de la protéine. Un tel processus de recyclage de l’albumine pourrait être similaire à celui décrit pour les immunoglobulines G au niveau du syncytiotrophoblaste.<p><p>Ces mouvement d’entrée et de sortie de l’albumine ne semblent pas associés à la stimulation de la libération d’hPL et d’hCG par l’albumine. Ils pourraient par contre participer significativement, étant donné leur ampleur, à la nutrition fœtale. L’albumine est en effet un transporteur notoire d’ions et d’acides gras, molécules qui pourraient être acheminées au fœtus via le phénomène de recyclage placentaire de l’albumine mis en évidence par ce travail. /<p><p>The human placenta is the site of all maternal-fetal exchanges, and is also an active endocrine organ. Placental lactogen (hPL) and chorionic gonadotrophin (hCG) hormones are synthesized by the syncytiotrophoblast. So far, the mechanisms involved in the regulation of both hormones secretion remain elusive. In vitro, calcium inflow causes an immediate and sustained rise in the hPL and hCG releases from human term placenta explants. Moreover, increasing the extracellular concentration of albumin, the major maternal plasma protein in direct contact with the human trophoblast, stimulates the hPL and hCG releases in an immediate and transient way.<p><p>Our study have aimed to check the specificity of this secretory effect of albumin, to investigate the potential cellular messengers involved in the hPL and hCG releases, and to define the interaction between albumin and the throphoblast layer, using human term placenta explants.<p><p>Our results indicate that the triggering effect of albumin (5%, w/v) is largely mimicked by two other colloidal agents (dextran and polygelin). This “colloidal” stimulation of the hPL and hCG releases would involve the mobilization of calcium from intracellular pools. Three cellular messengers have been considered to mediate this process: the IPs/DAG, the cAMP, and the cGMP. Sodium fluoride, forskolin, or sodium nitroprusside, known activators of respectively the IPs, cAMP, and cGMP production, significantly increase the placental content of each of those messengers, without modifying the hPL and hCG releases. In addition, raising the extracellular concentration of albumin does not cause any change in the placental level of IPs, cAMP, and cGMP, while stimulating the hormonal release. These three signaling pathways are thus functional in human term trophoblast but do not appear to significantly modulate the hPL and hCG secretions. <p><p>Our findings show that albumin, labeled with 125I or with fluorescein, is rapidly internalized into the syncytiotrophoblast. Thereafter, the intact protein is largely recycled to the maternal circulation, through a temperature-sensitive and cytoskeleton-independent process. The labeled albumin remaining in placental explants is partially degraded. Three different mechanisms could participate to the albumin entry into the human placenta: the albondin-mediated endocytosis via the caveolae, the clathrin-dependent coated pits system, and the megalin-mediated endocytosis. Using immunohistochemistry, caveolin-1, marker of the caveolae, is localized in the endothelium of the fetal capillaries and not in the syncytiotrophoblast. By contrast, clathrin and megalin are observed only in the syncytiotrophoblast. Methyl-b-cyclodextrin, and chlorpromazine hydrochloride, known inhibitors of the clathrin-dependent endocytotic process, significantly reduce the placental uptake of labeled albumin. On the other hand, DIDS or NPPB, able to perturb the megalin-mediated endocytosis, do not affect the labeled albumin uptake. Thus, albumin seems to be internalized into the syncytiotrophoblast mainly through a clathrin-dependent mechanism. Megalin would only play a minor role in this process. Such movements of albumin in the human placenta may be similar to the recycling process reported for IgG at that site.<p><p>The placental apical recycling of albumin is not associated to the albumin triggering effect on the hPL and hCG releases. This quantitatively significant internalization process may participate to the fetus’ nutrition. Indeed, Albumin carries ions and fatty acid, which could be brought to the fetus via the protein recycling evidenced by our study.<p><p><p> <p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le placenta assure les échanges materno-fœtaux et possède une fonction endocrine autonome. Les hormones placentaire lactogène (hPL) et chorionique gonadotrope (hCG) sont synthétisées par le syncytiotrophoblaste. A ce jour, les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion de ces deux hormones ne sont pas connus. In vitro, l’influx d’ions Ca2+ entraîne une augmentation immédiate et soutenue de la libération d’hPL et d’hCG à partir d’explants de placentas à terme. En outre, l’élévation de la concentration extracellulaire en albumine, principale protéine maternelle circulante en contact direct avec le trophoblaste, stimule de manière immédiate et transitoire la libération d’hPL et d’hCG. L’objectif de nos travaux a été de vérifier la spécificité de l’activité sécrétagogue de l’albumine au niveau du placenta, de caractériser les messagers cellulaires potentiellement impliqués dans la libération d’hPL et d’hCG, et de définir l’interaction entre l’albumine et le trophoblaste, en utilisant des explants provenant de placentas humains à terme. Nos travaux démontrent que la riposte sécrétoire à l’albumine (5%, m/v) est largement mimée par d’autres agents colloïdaux (dextran et polygéline). Cette stimulation colloïdale de la libération d’hPL et d’hCG impliquerait une mobilisation de Ca2+ à partir de réserves intracellulaires. L’intervention de 3 messagers cellulaires a été envisagée: les IPs/DAG, l’AMPc, et le GMPc. Le fluorure de sodium, la forskoline, ou le nitroprussiate sodique, activateurs connus de la production respective des IPs, de l’AMPc, et du GMPc, augmentent de manière significative les taux placentaires de chacun de ces messagers, sans toutefois affecter la libération d’hPL ou d’hCG. De plus, l’élévation de la concentration extracellulaire en albumine (5%, m/v) ne modifie pas les taux des IPs, de l’AMPc et du GMPc dans les explants placentaires, tandis qu’elle stimule la sécrétion hormonale. Ces systèmes de signalisation, bien que fonctionnels au niveau du trophoblaste, ne joueraient donc pas un rôle majeur dans la régulation de la libération d’hPL et d’hCG. Nos résultats mettent en évidence une internalisation rapide d’albumine marquée, avec de l’125I ou de la fluorescéïne, dans le syncytiotrophoblaste. Une large fraction de cette albumine est recyclée, intacte, vers la circulation maternelle selon un processus sensible à l’abaissement de la température et indépendant du cytosquelette. L’albumine marquée restant dans les explants placentaires est partiellement dégradée. Trois mécanismes ont été envisagés pour expliquer ces mouvements d’entrée et de sortie de l’albumine au sein du placenta humain: l’endocytose médiée par l’albondine via les caveolae, le système des coated pits clathrine-dépendant, et l’endocytose médiée par la mégaline. Par immunohistochimie, nous avons montré que, dans le tissu placentaire, la caveoline-1, protéine caractéristique des caveolae, est localisée uniquement dans l’endothelium des capillaires fœtaux. La clathrine, au niveau des coated pits, et la mégaline se trouvent au contraire dans le syncytiotrophoblaste. La méthyl-b-cyclodextrine et l’hydrochlorure de chlorpromazine, inhibiteurs d’une endocytose dépendant de la clathrine, réduisent significativement l’internalisation placentaire de l’albumine marquée. Par contre, le DIDS ou le NPPB, susceptibles de perturber l’endocytose médiée par la mégaline, n’affectent pas la captation d’albumine marquée par les explants placentaires. L’albumine pénétrerait donc dans le syncytiotrophoblaste principalement par un processus clathrine-dépendant. La mégaline ne jouerait ici qu’un rôle mineur dans l’entrée de la protéine. Un tel processus de recyclage de l’albumine pourrait être similaire à celui décrit pour les immunoglobulines G au niveau du syncytiotrophoblaste. Ces mouvement d’entrée et de sortie de l’albumine ne semblent pas associés à la stimulation de la libération d’hPL et d’hCG par l’albumine. Ils pourraient par contre participer significativement, étant donné leur ampleur, à la nutrition fœtale. L’albumine est en effet un transporteur notoire d’ions et d’acides gras, molécules qui pourraient être acheminées au fœtus via le phénomène de recyclage placentaire de l’albumine mis en évidence par ce travail. / The human placenta is the site of all maternal-fetal exchanges, and is also an active endocrine organ. Placental lactogen (hPL) and chorionic gonadotrophin (hCG) hormones are synthesized by the syncytiotrophoblast. So far, the mechanisms involved in the regulation of both hormones secretion remain elusive. In vitro, calcium inflow causes an immediate and sustained rise in the hPL and hCG releases from human term placenta explants. Moreover, increasing the extracellular concentration of albumin, the major maternal plasma protein in direct contact with the human trophoblast, stimulates the hPL and hCG releases in an immediate and transient way. Our study have aimed to check the specificity of this secretory effect of albumin, to investigate the potential cellular messengers involved in the hPL and hCG releases, and to define the interaction between albumin and the throphoblast layer, using human term placenta explants. Our results indicate that the triggering effect of albumin (5%, w/v) is largely mimicked by two other colloidal agents (dextran and polygelin). This “colloidal” stimulation of the hPL and hCG releases would involve the mobilization of calcium from intracellular pools. Three cellular messengers have been considered to mediate this process: the IPs/DAG, the cAMP, and the cGMP. Sodium fluoride, forskolin, or sodium nitroprusside, known activators of respectively the IPs, cAMP, and cGMP production, significantly increase the placental content of each of those messengers, without modifying the hPL and hCG releases. In addition, raising the extracellular concentration of albumin does not cause any change in the placental level of IPs, cAMP, and cGMP, while stimulating the hormonal release. These three signaling pathways are thus functional in human term trophoblast but do not appear to significantly modulate the hPL and hCG secretions. Our findings show that albumin, labeled with 125I or with fluorescein, is rapidly internalized into the syncytiotrophoblast. Thereafter, the intact protein is largely recycled to the maternal circulation, through a temperature-sensitive and cytoskeleton-independent process. The labeled albumin remaining in placental explants is partially degraded. Three different mechanisms could participate to the albumin entry into the human placenta: the albondin-mediated endocytosis via the caveolae, the clathrin-dependent coated pits system, and the megalin-mediated endocytosis. Using immunohistochemistry, caveolin-1, marker of the caveolae, is localized in the endothelium of the fetal capillaries and not in the syncytiotrophoblast. By contrast, clathrin and megalin are observed only in the syncytiotrophoblast. Methyl-b-cyclodextrin, and chlorpromazine hydrochloride, known inhibitors of the clathrin-dependent endocytotic process, significantly reduce the placental uptake of labeled albumin. On the other hand, DIDS or NPPB, able to perturb the megalin-mediated endocytosis, do not affect the labeled albumin uptake. Thus, albumin seems to be internalized into the syncytiotrophoblast mainly through a clathrin-dependent mechanism. Megalin would only play a minor role in this process. Such movements of albumin in the human placenta may be similar to the recycling process reported for IgG at that site. The placental apical recycling of albumin is not associated to the albumin triggering effect on the hPL and hCG releases. This quantitatively significant internalization process may participate to the fetus’ nutrition. Indeed, Albumin carries ions and fatty acid, which could be brought to the fetus via the protein recycling evidenced by our study.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le placenta humain est un organe indispensable au maintien de la grossesse et au développement fœtal. Son unité structurale et fonctionnelle est la villosité choriale, constituée principalement de cytotrophoblastes qui se différencient selon la voie villeuse endocrine ou extravilleuse invasive. Le développement intense du placenta et ses fonctions multiples requièrent des besoins en énergie importants. La régulation du métabolisme énergétique placentaire passe, en partie, par le contrôle de l’activité mitochondriale.La mitochondrie est l’organelle clé du métabolisme énergétique. Cependant, elle intervient dans de nombreuses autres fonctions cellulaires telles que l’apoptose et la biosynthèse des hormones stéroïdes. Des études récentes suggèrent que les mitochondries sont impliquées dans la différenciation cellulaire.Le récepteur apparenté aux récepteurs des oestrogènes-γ, (ERRγ), est un facteur de transcription qui joue un rôle crucial dans le contrôle du métabolisme énergétique. Des travaux préliminaires ont montré qu’ERR est fortement exprimé dans le placenta humain.Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l’implication d’ERRγ dans le développement placentaire.Dans une première partie, nous avons caractérisé l’expression d’ERRγ dans les trophoblastes de placentas humains de 1er et de 3ème trimestre. Nous avons montré que l’expression d’ERRγ i) augmente au cours de la grossesse et ii) est plus importante dans les cytotrophoblastes villeux en comparaison aux cytotrophoblastes extra-villeux.Dans une seconde partie, nous avons montré que la différenciation des cytotrophoblastes villeux est associée à des modifications du métabolisme énergétique et du contenu mitochondrial. De plus, nous avons clairement démontré qu’ERRγ contrôle positivement la différenciation des trophoblastes villeux en modulant les fonctions mitochondriales.Enfin, nous avons montré qu’ERRγ est moins exprimé dans les placentas issus de retards de croissance intra-utérins en comparaison à des placentas normaux. De plus, la diminution d’ERRγ est associée à une baisse du contenu mitochondrial placentaire.L’ensemble de ce travail a permis de mettre en évidence le rôle clé d’ERRγ et des mitochondries dans le développement du placenta humain. / Human placenta is a vital organ for pregnancy support and fetal development. The chorionic villi is the structural and functional unit of the placenta and is mainly constituted by trophoblastic cells. The trophoblast differentiate in villous endocrine and extra-villous invasive trophoblast. Placental development and its numerous functions require the availability of high energy. Placental energetic metabolism control is partially mediated by the regulation of mitochondrial activity.Mitochondria are key organelles of the energetic metabolism. However, mitochondria are involved in numerous other cellular functions such as apoptosis and steroid hormone biosynthesis. Moreover, recent studies suggest that mitochondria are involved in cell differentiation.Estrogen related receptor-γ (ERRγ) is a transcriptional factor implicated in the control of energetic metabolism. Preliminary studies showed that ERRγ is highly expressed in human placenta.In this work, we decided to study ERRγ implication in human placental development.In a first part, we characterized ERRγ expression in trophoblast from first and third trimester human placentas. We showed that ERRγ expression i) increased during pregnancy and ii) was higher in villous than extra-villous trophoblasts.In a second part, we showed that villous trophoblast differentiation was associated with modifications of energetic metabolism and mitochondrial content. Moreover, we clearly demonstrated that ERRγ positively controled villous differentiation by the modulation of mitochondrial functions.In a last part, we showed that ERRγ was less expressed in placentas from intra-uterine growth restriction as compared to non-pathological placentas. Moreover, this down-regulation was associated with a decrease of mitochondrial content.This work thus showed, for the first time, that ERRγ and mitochondria played a key role in placental development.

Thèse (D. en biochimie)--Université du Québec à Montréal, 2006. / En tête du titre: Université du Québec à Montréal. Comprend des réf. bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2006. / Titre de l'écran-titre (visionné le 14 mai 2007). Bibliogr.

Th.--Méd.--Nancy 1, 1983. N°: 56.

Dans le laboratoire du Dr. Charron, le gène Mekl a été inactivé par mutagenèse d'insertion et il a été démontré que les embryons Mekl'' mouraient à la mi-gestation à cause d'une vascularisation déficiente du placenta (Giroux et al., 1999). Chez les placentas Mekl'' la structure du labyrinthe (impliqué dans les échanges nutritifs et gazeux entre le fœtus et la mère) est réduite voire quasi-inexistante. Les objectifs de la présente thèse étaient (i) d'étudier en détails le phénotype placentaire Mekl'", (ii) d'étudier la signalisation de la voie ERK/MAPK in vitro dans un modèle cellulaire participant au développement du placenta, et (iii) de générer un allèle conditionnel de Mekl afin de faire le 'rescue' du placenta Mekï'~. Par marquage immunohistochimique, il a été montré qu'il y a plus de cellules apoptotiques et moins de cellules prolifératives dans la région chorion-allantois du placenta Mekt' en comparaison avec les placentas Mekt/+ . Des analyses westerns sur des extraits totaux de placentas ont montré que la voie ERK/MAPK est beaucoup moins activée chez les spécimens Mekl~'~. Chez les placentas Mekl*'*, il a été montré que MEK1/2 sont activés de façon ubiquitaire dans la région du labyrinthe alors que, ERK1/2 sont principalement activés au niveau des syncytiotrophoblastes (SCT). Chez les placentas Mekl'', bien que MEK2 soit fortement activé au niveau de la jonction chorion-allantois, aucune activation de ERK n'est détectée à la jonction chorion-allantois. Par hybridation in situ, en utilisant le gène Gcml comme un marqueur des précurseurs de SCT, il a été montré que chez les placentas Mekl"', les SCT sont déterminés au bon moment, semblent se différencier normalement, mais sont incapables d'envahir le chorion pour guider la formation du réseau vasculaire du labyrinthe. Ces résultats suggèrent l'implication de Mekl dans la migration et/ou la différenciation des SCT. Par ailleurs, nous avons aussi montré que chez les spécimens Mekl1 ''", la p38/MAPK est phosphorylée au niveau des cellules endothéliales entourant les vaisseaux sanguins fœtaux du labyrinthe. Ce résultat concorde avec les données publiées dans la littérature indiquant que la voie p38 /MAPK est impliquée dans l'angiogenèse. L'activation de p38/MAPK chez les placentas Mekl'1 ' semble normale. Nos résultats suggèrent donc que la voie ERK/MAPK serait essentielle pour la morphogenèse de la barrière formée par les SCT alors que la p38/MAPK serait plutôt impliquée dans l'angiogenèse des cellules épithéliales des vaisseaux sanguins du labyrinthe. D'autre part, plusieurs lignées de trophoblastes souches (TS : cellules souches participant activement dans la morphogenèse du placenta) Mekl+/+ et une lignée de TS Mek2'y ' ont pu être dérivés. Cependant, aucun TS Mekl' ' n'a pu être établi et deux des quatre lignées Mekl''' établies dans les conditions de culture de cellules TS, se sont avérées être des cellules embryonnaires souches (ES). Cette observation soulève plusieurs questions intéressantes en rapport au rôle de Mekl dans la prolifération et la différenciation des TS et/ou des cellules ES in vitro. Des travaux sont actuellement en cours dans notre laboratoire pour approfondir ces rôles. Un autre volet du présent projet était d'étudier le rôle de Mekl dans le développement de l'embryon proprement dit, il a été montré que lorsque les cellules ES Mekl'' sont agrégées avec des embryons tétraploïdes on arrive à générer des embryons et des placentas qui se développent normalement jusqu'au stade E13.5. Cependant, cette sauvegarde est incomplète, car l'embryon à E13.5 présente une morphologie légèrement anormale. Pour confirmer ce résultat, un allèle conditionnel chez lequel l'exon 3 de Mekl est flanqué par deux sites loxP (Mekl*10™) a été généré. L'excision de l'exon 3 génère un allèle nul de Mekl (MeklA ). En utilisant une lignée de souris transgénique exprimant la Crerecombinase spécifiquement dans l'épiblaste (Sox2Cre), des embryons MeklA/Aayant un placenta de type sauvage ont été généré. De plus, les souris MeklA/A sont viables et fertiles en l'absence de MEK1. En conclusion, les résultats décrits dans cette thèse suggèrent fortement que Mekl est requis principalement pour le développement des structures extra-embryonnaires du placenta murin. / Previously, it has been shown that Mekï' embryos die between E9.5-10.5 without any major embryonic malformations, while the placenta presented marked reduction in labyrinthine vascularisation (Giroux et al., 1999). By western analyses we showed that the ERK/MAPK pathway is much less activated in the Mekï ' placentas compared to wild type specimens. Our immunohistochemical analyses revealed that in Mekl+/+ placentas, MEKl/2 are ubiquitous and highly activated in the labyrinth (where gaseous and nutrient exchange take place between the fetus and the mother). ERK1/2 are activated mostly in syncytiotrophoblasts (SCT: ultimate barrier separating fetal and maternai blood flows in the labyrinth). In Mekï" placentas, MEK2 is mostly activated in the chorio-allantoic junction while ERK1/2 are activated exclusively in the allantois and not in the chorio-allantoic junction. Mekï'' placentas presented abnormal morphogenesis of the SCT barrier. Indeed, in Mekï'" placentas, we showed that SCT precursors (Gcm/-positive cells) are determined at the right moment (around E8.5), seemed to be able to differentiate but did not seem to be able to invade the chorion. We also showed that in Mekl*'+ specimens, the p38/MAPK pathway is phosphorylated in endothelial cells surrounding the labyrinthine fetal blood vessels. This observation is in accord with data published in literature assigning an important role of the p38/MAPK pathway in angiogenesis. Activation of the p38/MAPK pathway in Mekï' embryos seemed normal. Our results suggest that signaling through Mekl might be essential for SCT barrier morphogenesis. Furthermore, Giroux et al., (1999) showed that Mekï'" mouse embryonic fibroblasts failed to migrate in response to a fibronectin matrix. Hence we were interested to verify the migration and differentiation potentials of a cell type participating actively in placental development, i.e. trophoblast stem cells (TS). We managed to isolate several wild type and one Mekl'' TS cell lines while we did not obtain any Mekï'' TS. Interestingly, the cells obtained from Mekï'' blastocysts were mainly embryonic stem cells (ES). Hence these findings posed new questions concerning the implication of Mekl in the growth and maintenance of TS cells in vitro. Experiments are being carried out in our laboratory to pour light on these interrogations. Furthermore, we wanted to investigate the role of Mekl in the development of the embryo after E10.5. Using the tetraploid aggregation strategy, we were able to generate live E13.5 Mekl' ' embryos, hence suggesting that the Mekl phenotype is probably extra-embryonic and cell-autonomous. We confirmed thèse results by generating a conditional Mekl allele, in which the exon 3 of Mekl is flanked by two loxP sites (Mekla ° xed). By crossing this mouse with transgenic Cre mouse line (Sox2cre) expressing Cre recombinase specifically in the epiblast, we showed that the Mekl null {MeklA/A) mouse is viable and fertile. Our results demonstrate that Mekl is primordial for extraembryonic development in mouse.

Plus de deux millions d’enfants dans le monde vivent actuellement avec le virus d’immunodéficience humaine de type 1 (le VIH-1). De plus, les femmes, particulièrement celles en âge de procréer, sont plus vulnérables à cette infection. Or, 90% des infections par ce rétrovirus chez l’enfant sont attribuables à la transmission de la mère à l’enfant (TME). Quoique des traitements antirétroviraux soient disponibles pour la prévenir, seulement une infime proportion des femmes séropositives y a accès encore aujourd’hui. On estime donc que la transmission verticale du VIH-1 est un problème de santé public alarmant, non seulement pour les générations d’aujourd’hui, mais aussi pour celles de demain. La contamination fœtale est l’une des voies par laquelle la TME peut se produire. Cependant, les mécanismes qui y sont associés demeurent peu connus, particulièrement en ce qui concerne l’infection directe des trophoblastes, éléments structuraux du placenta. Afin d’éclaircir ce sujet, nous avons étudié, dans cette thèse, les évènements précoces du cycle réplicatif du VIH-1 dans les trophoblastes, première étape conduisant à l’infection d’une cellule cible. Nous avons découvert que le mécanisme d’infection des trophoblastes est inhabituel pour ce rétrovirus. En effet, le VIH-1, au contact de ces cellules, est internalisé par celles-ci et se retrouve alors dans les endosomes. Nous avons établi que l’endocytose du VIH-1 se fait par une voie indépendante de la clathrine, des cavéoles et de la dynamine-2, mais requérant toutefois que le cholestérol membranaire soit libre. Nous avons suivi le parcours intracellulaire des particules virales et noté qu’elles se rendaient principalement aux endosomes tardifs, transit contrôlé par les protéines Rab5 et Rab7. Quoique ce transport entraîne la dégradation d’une grande partie des virions, il est de façon étonnante essentiel à leur processus infectieux dans les trophoblastes. Finalement, l’accès du VIH-1 au cytoplasme cellulaire se fait en l’absence des protéines de l’enveloppe virale, la gp120 et la gp41, suggérant que le virus fusionne dans les endosomes grâce à la machinerie cellulaire présente. Les données présentées dans cette thèse décrivent donc une nouvelle voie d’infection pour le VIH-1. La compréhension de ce processus est essentielle si l’on veut mieux contrôler un jour la transmission mère-enfant du VIH-1 durant la grossesse et/ou trouver des solutions alternatives aux antirétroviraux existants. / More than two million children under fifteen years of age are currently living with the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) worldwide and 90% of these infections are associated with mother-to-child transmission (MTCT) of this retrovirus. Women, particularly those of child-bearing age, are highly susceptible to HIV-1 infection. In spite of available antiretroviral treatments to prevent MTCT, only a minority of infected women have access to these treatments. Hence, vertical transmission of HIV-1 is an alarming public health issue for both current and future generations. One of the postulated models for how HIV-1 is transmitted by the mother is foetal contamination. However, the mechanisms underlying such an event are poorly understood. In particular, the process whereby HIV-1 may directly infect trophoblasts, the structural cells of the placenta, is unknown. In this thesis, we have studied the early events associated with HIV-1 life cycle in trophoblasts, the first step towards infecting a target cell. Our data demonstrate that the mechanism whereby HIV-1 infects trophoblasts is unusual for this retrovirus. Upon contact with these cells, HIV-1 is rapidly and massively endocytosed. We have tracked the step-by-step movements of incoming particles and found that HIV-1 traffics primarily towards late endosomes, via Rab5 and Rab7. Surprisingly, although this transit leads to the degradation of the majority of the internalized virions, it is necessary for HIV-1 to establish a productive infection in these cells. In addition, we found that endocytosis of HIV-1 in these placental cells relies on a clathrin-, caveolae- and dynamin-independent pathway that requires free membrane cholesterol. Finally, viral entry occurs in the absence of the viral envelope glycoproteins, gp120 and gp41, suggesting that HIV-1 undergoes fusion within the endosomes via the host cell machinery. Collectively, the data presented in this thesis describe a novel infection pathway for HIV-1. An understanding of this unique process is essential if we are to learn how to control MTCT and/or find alternate solutions to existing antiretroviral drugs.