Heidelberg, Univ., Diss., 2008.

Tübingen, Univ., Diss., 2005.

GDF-15 ist ein atypisches Mitglied der TGF-b-Superfamilie. Unter physiologischen Bedingungen kommt es nur in der Plazenta in größeren Mengen vor, während es in zahlreichen Tumoren überexprimiert gefunden wurde. Die genaue Funktion von GDF-15 im Tumorkontext ist nicht genau geklärt. Aufgrund der häufigen und hohen Expression in Tumoren scheint GDF-15 eine wesentliche Funktion im Tumorprogress auszuüben. Das Ovarialkarzinom (OvCA) nimmt die Stellung als tödlichste gynäkologische Erkrankung ein. Da der Tumor meist erst in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert wird, sind bis heute die Heilungschancen schlecht. Häufig kommt es zum Rezidiv nach zunächst erfolgreicher Chemotherapie und mit 30% ist die 5-Jahres-Überlebenschance gering. Für die chemoresistenten Fälle gibt es bis zum heutigen Zeitpunkt keine effektive Therapie. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, neue innovative Therapiestrategien zu entwickeln. Günstige immunologische Parameter korrelieren mit der Überlebensdauer von OvCA-Patientinnen, was die Immuntherapie beim OvCA in den Fokus der experimentellen klinischen Therapie rückt. Doch um neue immuntherapeutische Strategien entwickeln zu können, müssen zunächst immunologisch relevante Angriffspunkte identifiziert werden. Das in vielen Tumoren exprimierte GDF-15 ist mit einem der stärksten immunsuppressiven Faktoren verwandt, was die Vermutung nahe legt, dass auch GDF-15 eine immunologisch relevante Funktion im Tumorkontext ausüben könnte. Daher wurden die Expression und die mögliche Funktion von GDF-15 als Immunmodulator im Ovarialkarzinom untersucht. Expressionsanalysen von OvCA-Gewebe und primären OvCA-Zellen zeigten, dass GDF-15 das am stärksten überexprimierte Gen der untersuchten TGF-b-Familienmitglieder im OvCA ist. Auch als sezerniertes Protein wird GDF-15 in vivo und in vitro im OvCA detektiert, was auf eine funktionale Rolle von GDF-15 im OvCA hindeutet. Normalerweise eliminiert das Immunsystem entartete körpereigene Zellen. Manchmal gelingt es Tumorzellen jedoch, sich dieser Immunüberwachung zu entziehen und dem Immunsystem zu „entwischen“. Inwieweit GDF-15 bei der Koordination des „immune escape“ des OvCA eine Rolle spielt, sollte im Fokus dieser Arbeit stehen. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf der Wirkung von GDF-15 auf NK-Zellen, da diese als frühe Effektoren und wichtige Mediatoren zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem nicht nur eine Schlüsselrolle bei der immunologische Überwachung spielen, sondern sich dadurch auch als ideale Werkzeuge für die Tumorimmuntherapie auszeichnen. Exogenes GDF-15 hemmt in vitro die Lyseaktivität von NK-Zellen gegenüber OvCA-Zellen. Endogene GDF-15-Defizienz der OvCA-Zellen sensitiviert diese für NK-Zell-Lyse und endogene GDF-15-Überexpression mindert die NK-Lyseaktivität. Die Hemmung der NK-Lyseaktivität kann durch verschiedene synergistisch wirkende Mechanismen erfolgen: durch Rezeptormodulation, durch direkte Modulation des Lysemechanismus und durch Apoptoseregulation. Wie TGF-b1 reguliert GDF-15 die Expression des aktivierenden NK-Rezeptors NKG2D von der Zelloberfläche herunter und induziert zusätzlich die Expression des inhibierenden Rezeptors CD305 und die des mit NKG2A- und NKG2C-assoziierten Rezeptors CD94. Daneben greift GDF-15 direkt in den Lysemechanismus der NK-Zellen ein, indem es die Granzym B-Expression beeinflusst. Darüber hinaus sensitiviert GDF-15 Immunzellen für die Apoptose durch die Induktion von Fas/CD95. Signaltransduktionsanalysen zeigen, dass GDF-15 in Immunzellen die SMAD-Proteine zeitverzögert zu TGF-b aktiviert, was auf eine indirekte Wirkung schließen lässt. Zusätzlich kann GDF-15 auch die die p38/MAPK in Immunzellen aktivieren. Die Genregulation von GDF-15 und TGF-b1 in NK-Zellen ist sehr verschieden. Beide Zytokine regulieren überwiegend Gene aus gleichen Funktionalitätsclustern, allerdings sind die einzelnen von TGF-b1 und GDF-15 regulierten Gene verschieden. Nur drei Gene (CD55, Caspase-8 und Apolipoprotein 6) sind durch GDF-15 und TGF-b1 gleich reguliert. Zusammengefasst zeigt sich eine funktionale Analogie von GDF-15 und TGF-b1 in NK-Zellen. TGF-b1 scheint eine stärkere Wirkung zu induzieren, dafür zeigt GDF-15 hier ein breiteres Funktionalitätsspektrum. Durch die Charakterisierung der funktionalen Rolle von GDF-15 als Immunmodulator in Tumoren ist hier ein neuer potentieller Angriffspunkt identifiziert worden, welcher Grundlage für neue Tumortherapiestrategien, nicht nur für das OvCA, sondern auch für andere GDF-15-exprimierende Tumore sein kann. / GDF-15 is an atypical member of the TGF-b superfamily. Under physiological conditions it is expressed primarily in the placenta, whereas it is over-expressed in many tumors. So far, the exact function of GDF-15 in tumor context remains unknown. Due to the high and frequent expression in different tumors GDF-15 might play an important role in tumor progression. Ovarian cancer (OvCA) is one of the most deadly gynaecological malignancies. Often OvCA is diagnosed in late stages and therapies frequently fail. Initially, chemotherapy is successful but in many cases tumors re-grow and the 5-year survival rate is less than 30%. Until now, no cure for chemoresistent OvCA exists which demonstrates the need for new experimental strategies. Immunotherapy is one major subject of experimental OvCA therapy, as favorable immunological parameters correlate with the survival of OvCA patients. In order to design new immunotherapeutic strategies against OvCA reliable and immunologically relevant targets have to be identified. GDF-15 is not only highly expressed in different tumors but is also closely related to one of the most immunosuppressive factors known suggesting a potential immunosuppressive role for GDF-15 itself. Thus, in this work GDF-15 expression and potential function as an immune modulator in ovarian cancer is analyzed. Expression analyses of OvCA tissue and primary OvCA cells reveal GDF-15 with the highest over-expression in OvCA of all analyzed TGF-b family members on RNA and protein level in vivo and in vitro. This high expression suggests a functional involvement of GDF-15 in ovarian carcinogenesis. The immune system is able to eliminate altered cells but sometimes tumor cells escape from this immune surveillance. Thus, this work focuses on the contribution of GDF-15 to the immune escape of OvCA. NK cells act as early cytotoxic effectors against tumors and represent important immune mediators with impact on innate and adaptive immunity. In vitro, exogenous GDF-15 inhibits NK cell lysis against OvCA cells. Additionally, GDF-15 deficient OvCA cells are killed more efficiently in NK lysis assays than GDF-15 over-expressing OvCA targets. Inhibition of NK cell lysis can occur by different synergistic mechanisms: receptor modulation, direct inhibition of cytotoxic functions and apoptosis regulation. Like TGF-b GDF-15 down-regulates NKG2D receptor expression and furthermore, induces the expression of the inhibitory receptor CD305 and the NKG2A and NKG2C associated receptor CD94. Additionally, GDF-15 interferes directly with the cytolytic activity of NK cells by reducing granzyme B expression. Moreover, GDF-15 sensitizes immune cells for apoptosis by up-regulation of CD95/Fas. Signal transduction analyses reveal a delay in GDF-15 dependent SMAD signaling in immune cells compared to that of TGF-b suggesting a rather indirect effect of GDF-15. But GDF-15 can additionally activate p38/MAPK in immune cells. GDF-15 and TGF-b dependent gene regulation in NK cells is different although regulated genes cluster in the same functional groups. Only three genes (CD55, caspase-8 and Apolipoprotein 6) are regulated in a similar way. In summary, GDF-15 and TGF-b show similar immune modulating characteristics. TGF-b seems to be more potent mostly achieving a more powerful effect but here, GDF-15 showed a broader mechanistic spectrum. The functional role of GDF-15 as an immune mediator in tumor context reveals an interesting new target for experimental therapy not only for OvCA but for all GDF-15 producing tumors.

Der humane, monoklonale IgG Antikörper BARB-4 konnte mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem an Magenkarzinom erkrankten Patienten isoliert werden. BARB-4 stellt aufgrund seiner Keimbahnkodierung einen Bestandteil der innaten Immunität dar und ist eines der wenigen tumorspezifischen IgG Immunglobuline, die diesem Teil des Immunsystems zugeordnet werden können. Innerhalb dieser Arbeit konnte die Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und näher charakterisiert werden. Das BARB-4 Antigen wurde hierbei über ein affinitätschromatographisches Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und anschließend mittels MALDI-MS über die Peptidmassen-Fingerprint Methode analysiert. Das dabei isolierte Protein konnte eindeutig als humanes TAF15 identifiziert werden. Diese auf der Zellmembran von Tumoren exprimierte TAF15 Variante besitzt ein Molekulargewicht von etwa 78 kDa. Sie kommt im Gegensatz zum Wildtyp exklusiv in Tumorzellen vor und konnte nicht in Normalgewebe nachgewiesen werden. Immunhistochemische Untersuchungen mit BARB-4 und Anti-TAF15 Antikörper auf Tumor- und Normalgewebe deuteten dabei auf eine Koexistenz von Wildtyp und tumorspezifischer TAF15-Variante in malignem Gewebe hin und legten somit eine tumorspezifische Modifikation des TAF15BARB-4 nahe. Ein Carbohydrat-Epitop, wie es sehr häufig bei den natürlichen IgM Antikörpern vorkommt, konnte hier jedoch ausgeschlossen werden. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Bindung des BARB-4 Antikörpers auf Tumorzellen einen Einfluss auf diverse zelluläre Prozesse ausübt. Durch die Bindung hemmte der Antikörper das Zellwachstum von Tumorzellen und induzierte deren Apoptose. Weitere interessante Eigenschaften des BARB-4, die bei Tumorzellen beobachtet werden konnten, sind vor allem für metastasierende Zellen von Bedeutung. Nach erfolgter Antikörperinkubation konnte bei Tumorzellen eine Inhibierung der Zelladhäsion und der Zellbeweglichkeit nachgewiesen werden. Diese beiden zellulären Prozesse sind wichtig für sich im Körper ausbreitende, maligne Zellen. In allen durchgeführten Analysen handelte es sich um vom Antikörper direkt vermittelte Effekte. Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um das Bindungsverhalten des Antikörpers genauer charakterisieren zu können. Immunfluoreszenzanalysen zeigten dabei, dass der Antikörper BARB-4 nach der Bindung an die Tumorzellmembran internalisiert wird. Die Erforschung des BARB-4 Antikörpers und seiner Zielstruktur TAF15BARB-4 auf Krebszellen ermöglicht sowohl neue Einblicke in die Funktionsweise der innaten Immunität als auch neue Optionen für die zielgerichtete Tumortherapie. Die Identifizierung einer extrazellulären, tumorspezifischen TAF15 Variante bietet eine neue Möglichkeit für Diagnostik- und Therapieansätze. Durch die exklusive Expression auf Tumorzellen ermöglicht diese TAF15-Variante gezielt maligne Zellen zu attackieren ohne dabei gesunde Zellen zu beeinflussen. Durch das Vorkommen des TAF15BARB-4 in den verschiedensten Tumorentitäten könnte diese Zielstruktur für die Therapie vieler unterschiedlicher, maligner Erkrankungen genutzt werden. Aufgrund seiner funktionellen Eigenschaften, wie der Hemmung der Tumorzellmotilität und Tumorzelladhäsion, könnte der BARB-4 Antikörper besonders für die Prävention einer Metastasierung von Bedeutung sein. / BARB-4, a human monoclonal IgG antibody originally isolated from a stomach cancer patient using human hybridoma technology, is a germ-line encoded and innate immunity-related antibody, as are only few other tumor-specific IgG immunoglobulins. In this study, the antigen of the BARB-4 antibody was identified and characterized. The potential target was isolated from tumor cell membrane extracts using affinity chromatography and further analyzed by a peptide mass fingerprint method (MALDI-MS). By this approach, we identified a human TAF15 protein with a molecular weight of approximately 78 kDa. In contrast to the wild-type TAF15 protein, this TAF15 variant is exclusively present in tumor cells and could not be detected in normal tissue. Immunohistochemical stainings revealed a coexistence of wild-type TAF15 and tumor-specific TAF15BARB-4 in malignant tissue suggesting a tumor-specific modification of BARB-4 antigen. Importantly, a carbohydrate as potential epitope, typical for natural IgM antibodies, could be excluded. Functional analyses demonstrated that BARB-4 inhibits proliferation of tumor cells and induces apoptosis. In addition, incubation of tumor cells with BARB-4 diminished cell adhesion and motility, which are crucial steps during formation of metastases. We applied additional assays to obtain more detailed information about the binding properties of the antibody. Specifically, immunofluorescence approaches confirmed binding of BARB-4 to the tumor cell surface and its subsequent internalisation by endocytosis. All these findings appear to be directly antibody-mediated effects. The characterization of the BARB-4 antibody and its target TAF15BARB-4 may lead to deeper insights into the function of the innate immune system. Moreover, the identification of a tumor-specific antibody offers novel opportunities for the diagnosis of malignant tumors and may foster the development of novel, antibody-based therapeutic approaches. Based on the exclusive expression of TAF15BARB-4 on tumor cell surface, BARB-4 enables the discrimination of malignant and normal tissues, and the expression of TAF15BARB-4 in various cancer entities might be the basis for the development of tumor-specific therapies. By arresting tumor cell adhesion and tumor cell motility, BARB-4 could be especially useful for the prevention of metastases in malignant tumors.

Univ., Diss., 2010--Würzburg.

Das DNA-Mismatch-Reparatur-(MMR-) System ist das einzig bekannte postreplikativ arbeitende DNA-Reparatur-System. Es wurde gezeigt, dass die MMR-Aktivität für den Erhalt der genomischen Stabilität in Prokaryoten und Eukaryoten notwendig ist. Defekte in Genen des MMR-Systems (wie beispielsweise MLH1 oder MSH2) wurden als Ursache für die Entstehung des hereditären nicht-polypösen kolorektalen Karzinoms (HNPCC) und anderen Tumorarten beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde die Tumorgenese in Mlh1 defizienten Mäusen (Mlh1-/-) untersucht und eine umfassende Charakterisierung der hier auftretenen Lymphome vorgenommen und die Bedeutung des Immunsystems für die Tumorgenese in Mlh1 defizienten Mäusen durch Einkreuzen zusätzlicher Immundefizienzen erruiert. Die auf einen reinen genetischen Hintergrund zurückgekreuzten Mlh1-/--Mäuse zeigten eine in zwei Wellen ablaufende Tumorgenese: Eine frühe Phase, in der Mäuse lymphoide Tumoren entwickelten und eine spätere Phase, in der die Mlh1-/--Tiere vorwiegend an Gastrointestinaltumoren erkrankten. Wir konnten zeigen, dass die Mlh1 defizienten Mäuse ein breiteres Lymphomspektrum, als beispielsweise Msh2 defiziente Tiere aufweisen. Eine Vielzahl der untersuchten Lymphome Mlh1 defizienter Mäuse war mikrosatelliteninstabil (MSI). Die Tatsache, dass mikrosatellitenstabile (MSS) Lymphome in den Mlh1-/--Tieren vorkamen, impliziert aber auch, das MMR-Defizienz nicht zwingend durch Mikrosatelliteninstabilität gekennzeichnet sein muss. Es ist möglich, dass sich eine Mikrosatelliteninstabilität erst zu einem späteren Zeitpunkt der Tumorentwicklung in MMR-defizienten Zellen manifestiert. Darauf deuten auch die MSI-Analysen der in den Rag-/-/Mlh1-/--Mäusen frühzeitiger als in Mlh1-/--Mäusen auftretenden Gastrointestinaltumoren hin. Einige dieser untersuchten Gastrointestinaltumoren in den Rag-/-/Mlh1-/--Mäusen waren mikrosatellitenstabil, wohingegen sämtliche Gastrointestinaltumoren der Mlh1 defizienten Mauspopulation Mikrosatelliteninstabilität aufwiesen. In einigen der untersuchten Lymphome fehlte die MHC Klasse I-Molekülexpression, was auf deutet den Einfluss des Immunsystems auf die Erkennung und Eliminierung von (durch MMR-Defizienz entstandenen) Tumoren hindeutet. Um die Art der Immunantwort und die verantwortlichen Komponenten des Immunsystems für die Abwehr MMR-defizienter Tumoren einzugrenzen, wurden verschiedene immunkompromitierte oder immundefiziente Mauslinien in Mlh1 defiziente Mäuse eingekreuzt. Dieses waren Mauslinien mit beta2Mikroglobulin- (b2m-/--), Perforin- (pfp-/--), beta2Mikroglobulin/Perforin- (b2m-/-/pfp-/--) und Recombination activation gene- (Rag-/--) Defizienz. Häufig wurde in diesen Tieren eine Verschiebung im Tumorspektrum und ein beschleunigtes zeitliches Auftreten der Tumoren beobachtet. Anhand dieser Modelle konnten wir demonstrieren, dass insbesondere die Regulierung der MHC Klasse I-Molekülexpression ein bedeutsamer Schritt für die Ausprägung verschiedener Lymphomarten ist, welcher das „Überleben“ der Tumorzellen gewährleistet. Auch die Notwendigkeit einer balancierten Expression von NK-Zell-stimulatorischen und –inhibitorischen Liganden auf der Tumorzelloberfläche, welche die Erkennung und Eliminierung von Tumorzellen durch Nicht-MHC Klasse I-abhängige Immunzellen (wie z.B. den Natürliche Killerzellen) reguliert, liess sich mit Hilfe der beta2Mikroglobulin- und Perforin-Mausmodelle aufzeigen. Offensichtlich sind für die in Mlh1 defizienten Mäusen vorkommenden verschiedenen Tumorarten unterschiedliche zelluläre Komponenten und Abwehrmechanismen des Immunsystems für die Erkennung und Eliminierung verantwortlich. So beeinflussen insbesondere cytotoxische T-Zellen (CTLs) die Entstehung von Gastrointestinaltumoren in Mlh1 defizienten Mäusen. Für die lymphoiden Tumoren ergab sich ein divergentes Bild. Hier beschränkte sich der Einfluss der CTLs bei der Lymphomabwehr auf die Erkennung und Eliminierung disseminierter T- und B-Zell-Lymphome. Die in den Mlh1-/--Mäusen nachgewiesenen thymischen T-Zell Lymphome dagegen unterlagen der perforin-vermittelten Zellabwehr durch Nicht-MHC Klasse I-beschränkte Immunzellen (z.B. Natürlichen Killerzellen). Die Relevanz der vorliegenden Mausmodelle wird deutlich, wenn man sich die Situation von immunsupprimierten Posttransplantationspatienten und immundefizienten HIV-Patienten vor Augen führt. Häufig beobachtet man in diesen Patientengruppen das Auftreten lymphoider Tumoren. Diese sind oftmals Mikrosatelliteninstabil, was auf eine vorliegende MMR-Defizienz hindeutet. Zudem zeigen diese Lymphome ähnliche Merkmale, wie die durch Mlh1-Defizienz entstandenen lymphoiden Tumoren. Insbesondere für Studien solcher Lymphome stellt die Mlh1-defiziente Maus mit den verschiedenen eingekreuzten Immundefizienzen ein geeignetes in vivo Model dar. / The DNA-Mismatch-(MMR-) Repair System is the only postreplicative working DNA repair system known so far. It was shown, that MMR activity is necessary for maintaining the genomic stability in prokaryotes and eukaryotes. Defects in MMR genes such as MLH1 or MSH2 were described in the hereditary non-polyposis colorectal carcinoma (HNPCC) and other tumors. The aim of this thesis was the analysis of the tumorigenesis and a detailed characterization of the lymphoid tumors of Mlh1 deficient mice. Additionally, by crossing the Mlh1-/--mice with different immune compromised animals, the impact of the immune system on the tumorigenesis in Mlh1 deficient mice was studied. The tumorigenesis in the Mlh1-/--mice (crossed on a pure genetic background) occurred in two waves: one early phase with predominant development of lymphoid tumors and a later phase characterized by mainly gastrointestinal tumors. The majority of lymphomas were histologically defined as lymphomas of a lymphoblastic T- and B-cell type. The lymphoma types grouped by immunophenotyping were different, depending on their expression of surface molecules (MHC class I, Rae-1) and genes that are relevant for the development of lymphoid cells (like TdT, Rag, Pax5, E2a). Based on these findings, and subgrouping the lymphomas according to their location (thymus-located and disseminated lymphomas) we found a broad spectrum of lymphoid tumors. In comparison to Msh2 deficient mice which exclusively developed thymic T cell lymphomas (and gastrointestinal tumors) we observed an additional appearance of disseminated T cell and B cell lymphomas in the Mlh1 deficient mouse population. The analysis of microsatellite instability (MSI) as a hallmark of the human hereditary colorectal carcinoma (HNPCC) has been shown to represent an appropriate method for other tumor entities, as the majority of lymphomas in Mlh1 deficient mice were microsatellite instable. On the other hand, the finding of microsatellite stable (MSS) lymphomas implies that Mismatch Repair- (MMR-) deficiency is not necessarily characterized by microsatellite instability. One possible explanation might be that MSI in MMR deficient cells are manifested at a later timepoint of tumorigenesis. This notion is supported by the occurence of microsatellite stabile (MSS) gastrointestinal tumors found in Rag-/-/Mlh1-/--animals. All of the gastrointestinal tumors analyzed in Mlh1-/--mice were microsatellite instable (MSI) and arised later. Frequently, lymphomas in Mlh1-/--mice were lacking the expression of MHC class I molecules. This finding suggests a possible influence of immune recognition and elimination of the MMR deficient tumors by the immune system. To narrow down the kind of immune response and the responsible components of the immune system involved in the recognition of MMR deficient tumors, we crossed immunocompromised or immunodeficient mouse strains into Mlh1 deficient mice. This were the beta2microglobulin-(b2m-/--), perforin-(pfp-/--), beta2micro-globulin/perforin-(b2m-/-/pfp-/--), and recombination activation gene-(Rag-/--) deficient strains. The additional immunodeficiencies, frequently led to a shifted spectra and onset of the tumors in the Mlh1-/--mice. The crucial importance of MHC class I molecule expression for the development of different lymphoma entities was shown by using these additional models. A regulation of MHC class I molecules is important for the tumor cells survival. Consequently, crossing immunodeficiencies (b2m-/-- and/or pfp-/-) into the Mlh1-/--mice revealed the importance of a balanced expression of natural killer-(NK-) cell stimulatory and inhibitory ligands on the surface of tumor cells. Obviously the different tumor entities observed in Mlh1 deficient mice are controlled by different cellular components and mechanisms exerted through the immune system. The cytotoxic T cells (CTLs) had a strong impact on the gastrointestinal tumorigenesis in Mlh1 deficient mice. A divergent situation was observed in the group of lymphoid tumors: the recognition and elimination by CTLs seemed to be restricted to the subgroups of disseminated T and B cell lymphomas, whereas the thymic T-cell lymphomas were eliminated by the Non-MHC class I-restriced immune cells (e.g. NK cells) via the perforin-mediated (granzyme) pathway. The relevance of these mouse models becomes evident by a comparison of human lymphomas that are frequently found in immune-suppressed postransplantation patients and in HIV-patients. These lymphomas are mostly microsatellite instable, indicating an MMR deficiency. Thus, these tumors are displaying similar features compared to the lymphoid tumors of Mlh1-/--mice, with the additional immunodeficiencies crossed in as described here representing an appropriate in vivo model for further studies.

Aim of this thesis was to study the contribution of the hosts immune system during tumor regression. A wild-type rejection model was studied in which tumor regression is mediated through an adaptive, T cell host response (Research article 1). Additionally, the relationship between VACV infection and cancer rejection was assessed by applying organism-specific microarray platforms to infected and non-infected xenografts. It could be shown that tumor rejection in this nude mouse model was orchestrated solely by the hosts innate immune system without help of the adaptive immunity. In a third study the inflammatory baseline status of 75 human cancer cell lines was tested in vitro which was correlated with the susceptibility to VACV and Adenovirus 5 (Ad5) replication of the respective cell line (Manuscript for Research article 3). Although xenografts by themselves lack the ability to signal danger and do not provide sufficient proinflammatory signals to induce acute inflammation, the presence of viral replication in the oncolytic xenograft model provides the "tissue-specific trigger" that activates the immune response and in concordance with the hypothesis, the ICR is activated when chronic inflammation is switched into an acute one. Thus, in conditions in which a switch from a chronic to an acute inflammatory process can be induced by other factors like the immune-stimulation induced by the presence of a virus in the target tissue, adaptive immune responses may not be necessary and immune-mediated rejection can occur without the assistance of T or B cells. However, in the regression study using neu expressing MMC in absence of a stimulus such as a virus and infected cancer cells thereafter, adaptive immunity is needed to provoke the switch into an acute inflammation and initiate tissue rejection. Taken together, this work is supportive of the hypothesis that the mechanisms prompting TSD differ among immune pathologies but the effect phase converges and central molecules can be detected over and over every time TSD occurs. It could be shown that in presence of a trigger such as infection with VACV and functional danger signaling pathways of the infected tumor cells, innate immunity is sufficient to orchestrate rejection of manifested tumors. / Ziel dieser Arbeit war, die Beteiligung des Wirts-eigenen Immunsystems bei der Tumoregression zu analysieren. Mittels eines Wildtyp-Regressionsmodells, wurde der Anteil des adaptiven Immunsystems studiert (Research-Artikel 1). Mit Hilfe von Organismus-spezifischen Mikroarrays und Genexpressionsanalysen konnte in einem Nacktmausmodell gezeigt werden, dass erfolgreiche, durch onkolytische VACV-vermittelte Tumortherapie auch ohne Beteiligung des adaptiven Immunsystems möglich ist (Research Artikel 2). In einer dritten Studie wurden 75 humane Tumorzelllinien auf ihren intrinsischen Entzündungsstatus hin getestet und bezüglich eines Zusammenhanges von diesem mit der Replikationsfähigkeit von VACV und Adenovirus 5 (Ad5) analysiert (Manuskript für den Research-Artikel 3). Obwohl Xenografts allein kein ausreichendes „Gefahrsignal“ geben und durch das Fehlen einer pro-inflammatorischen Stimulierung keine akute Entzündung verursachen können, ist die Infektion mit onkolytischem VACV ausreichend, um den Gewebe-spezifischen „Trigger“ darzustellen. In diesem Fall wird die Immunantwort aktiviert und nach der Hypothese des „Immunologic Constant of Rejection“ (ICR) geschieht dies, wenn eine chronische in eine akute Inflammation verändert wird. In dem beschriebenen onkolytischen Regressionsmodell ist die Präsenz des Virus ausreichend, um das Immunsystem zu aktivieren, d.h. die chronische Entzündung im Tumor in eine akute umzuwandeln. Dabei ist die adaptive Immunität mit T- und B-Zell-Aktivierung nicht notwendig für die Rückbildung des Tumors. In Abwesenheit eines solchen Stimulus, wie in der ersten Studie mit neu-exprimierenden MMCs, wird die Spezifität der adaptiven Immunantwort benötigt, um die akute Inflammation anzustoßen und die Tumorregression voranzutreiben. Zusammengefasst unterstützt diese Arbeit die Hypothese, dass die Mechanismen, die zu „tissue specific destruction“ (TSD) führen, in verschiedenen immunologischen Erkrankungen zwar divergieren, der Effektor-Mechanismus aber stets der Gleiche ist. Es zeigte sich, dass in Anwesenheit eines „triggers“, wie z.B. der VACV-Infektion und intakten „danger signaling pathways“ der Tumorzellen, die angeborene Immunität allein ausreicht, um die Tumorrückbildung zu vermitteln.

Das Neuroblastom (NB) zählt zu den therapieresistentesten Tumoren des Kleinkindalters. Besonders NB-Patienten mit MYCN-Amplifikation sind mit einer schlechten Prognose konfrontiert. Neuere Studien legen nahe, dass eine spezifische aktive Immuntherapie gegen MYCN ein vielversprechender Ansatz zur Bekämpfung dieser malignen Erkrankung darstellen könnte. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurde ein sogenanntes Minigen-Vakzin, welches für drei ausgewählte Epitope aus der MYCN-AS-Sequenz kodiert, generiert. Die Auswahl der Minigen-Epitope erfolgte mit dem MHC-Liganden-Vorhersageprogramm syfpeithi, welches drei starke H2-Kk-Liganden lieferte. Außerdem wurden zwei weitere Vakzine hergestellt: als Negativkontrolle MYCNLow, dessen MYCN-Peptide laut syfpeithi schlechte MHC-Klasse-I-Liganden darstellen und ein cDNA-Vakzin auf Basis der gesamten MYCN-cDNA-Sequenz. Zur Applikation der Vakzine wurden attenuierte Salmonella typhimurium SL7207 verwendet, die eine zusätzliche Stimulierung des mukosalen Immunsystems hervorrufen. Für die Untersuchung der Impfstoffe in vivo wurden zwei neuartige immunkompetente NB-Mausmodelle etabliert. Dazu wurden die syngenen NXS2/C1300 A/J-Mausmodelle soweit modifiziert, dass sie über eine induzierbare MYCN-Expression verfügten. Nach Auswahl und Charakterisierung geeigneter Transfektanten in vitro und in vivo wurde in diesen Modellen die Wirksamkeit der Vakzine untersucht. In diesen Versuchen konnte mit Hilfe der Vakzine das Primärtumorwachstum von NXS2-MYCN in geimpften Tieren signifikant im Vergleich zu Kontrollen reduziert und die Metastasierung durch C1300-MYCN Zellen signifikant verzögert werden. Mit den in-vivo-Versuchen anschließenden Analysen wurde schließlich bewiesen, dass die Immunantwort durch tumorinfiltrierende MYCN-spezifische zytotoxische CD8+ T-Zellen vermittelt wird. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine MYCN-DNA-Vakzinierung erfolgreich zur Behandlungen MYCN-exprimierender NB im Mausmodell eingesetzt werden kann. / High-level expression of MYCN protein caused by amplification of the gene characterizes a malignant phenotype of neuroblastoma (NB). Recent studies suggest that MYCN might be a promising target for immunotherapy. Therefore, we investigated the efficacy of three MYCN-specific DNA vaccines. Two minigene vaccines were generated; each encoded for three selected epitopes of the MYCN protein sequence with the highest, or as a control lowest, predicted affinity to MHC-Class-I Molecules. The third vaccine based on the cDNA of MYCN. Salmonella typhimurium SL7207 were used as oral application vehicle for the vaccines in in vivo experiments to induce an additional stimulation of the immune system. To investigate the immunotherapeutic approach NXS2- and C1300-cells syngeneic to immunocompetent A/J-mice were stably transfected with a tetracycline inducible vector system coding for MYCN. The transfectants were characterized and established in vitro and in vivo. In the MYCN-overexpressing models vaccination with the MYCN-DNA-vaccines resulted in significant reduced primary tumor growth or decelerated metastasis spread. The immune responses in the in vivo experiments followed by orally applied MYCN-DNA vaccines was mediated by tumor infiltrating cytotoxic CD8+ and CD4+ T cells. MYCN specificity of infiltrating lymphocytes was verified by MYCN-specific cytolytic activity and IFN-gamma secretion ex vivo. Finally, we showed that blocking of MHC-class I molecule H2-Kk approbated cytotoxicity mediated by CD8+ T cells, indicating MYCN specificity of the induced immune response. In summary, we showed that a MYCN based DNA vaccination strategy is effective against MYCN-expressing NB in vivo. In light of the description of MYCN-specific T cells in NB patients, the lytic action of autologous T cells on MYCN-expressing cells and the results of this study underline the possible potential of an active immunotherapy against MYCN as an alternative therapeutic approach to treat NB.

Das Neuroblastom ist ein vom sympathischen Nervensystem ausgehender neuroektodermaler maligner Tumor des Kleinkindesalters. Bei über 50% der Neuroblastom-Ersterkrankungen liegt bereits das disseminierte Stadium 4 vor, das eine infauste Prognose hat. Eine wirksame Behandlung des Stadium 4 Neuroblastoms stellt deshalb nach wie vor eine der größten Herausforderungen der pädiatrischen Onkologie dar: Die Gesamtüberlebensrate von 20-25% der Kinder, die an dieser bösartigen Krankheit leiden, konnte während der letzten zwei Jahrzehnte trotz neuer Chemotherapie-Protokolle nicht wesentlich verbessert werden. Aus diesem Grund gibt es zunehmend Bestrebungen sich um Therapiealternativen zu bemühen. In dieser Arbeit werden die derzeit möglichen immunologischen Strategien zur Behandlung des Neuroblastoms abgehandelt. / Neuroblastoma is a neuroectodermal malignancy of early childhood derived from sympathetic nervous tissue. At initial diagnosis over 50% of patients present with disseminated stage 4 disease which has a dismal prognosis. Effective treatment of patients with stage 4 neuroblastoma remains a major challenge in pediatric oncology. Despite novel therapeutic approaches including chemotherapy and autologous stem cell transplantation the overall survival rate of only 20-25% did not improve over the last two decades. Therefore, a lot of effort has been made to develop novel alternative therapies. This thesis summarizes possible immunotherapeutic strategies for the treatment of neuroblastoma.

Das La-Protein wurde als Autoantigen bei Autoimmunpatienten, die an SLE oder Sjögren-Syndrom erkrankt sind, entdeckt. Es kommt in phosphorylierter Form im Zellkern aller Eukaryonten vor und nimmt Aufgaben bei der Faltung, Prozessierung und nukleären Retention von RNA-Polymerase III-Transkripten wahr. Unter normalen zellulären Bedingungen ist das La-Protein außerdem in der Lage, zwischen Zellkern und Zytoplasma zu pendeln. Bei Zellstress, der nach UV-Exposition oder während einer viralen Infektion entsteht, wird das Protein verstärkt im Zytoplasma beobachtet, wo es an der Cap-unabhängigen Translation zellulärer und ggf. viraler Proteine beteiligt ist. Wird in der Zelle daraufhin Apoptose induziert, so ist das La-Protein auf der Zellmembran bzw. in apoptotischen Körperchen nachweisbar. Ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit war die Untersuchung verschiedener monoklonaler anti-La-Antikörper. Einige wenige konnten durch wiederholte Immunisierung von Mäusen mit rhLa-Protein generiert werden. Im Gegensatz dazu resultierte die einmalige Übertragung von gegen das hLa-Protein aktivierten CD4+ T-Zellen auf eine hLaTg-Maus in der Gewinnung mehrerer La-spezifischer Antikörper. Die Sequenzanalyse der Gene, die für die variablen Antikörperdomänen codieren, bestätigte, dass es sich um individuell rekombinierte und hypermutierte Immunglobuline handelt. Die Antikörper zeichneten sich außerdem durch unterschiedliche Eigenschaften bei der Bindung von humanem und murinem La-Protein in der Immunfluoreszenz, im Immunoblot oder während der Immunpräzipitation aus. Für die IgG-Antikörper konnten die Epitopbereiche innerhalb des La-Proteins eingegrenzt werden. Auffällig waren die kurzen linearen Peptidepitope, die von den auf konventionelle Art erzeugten Antikörpern gebunden wurden. Hingegen erkannten alle Antikörper, die aus dem adoptiven T-Zell-Transfer hervorgegangen waren, Konformationsepitope. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass einige mAks aber auch anti-La-Patientenseren die reduzierte von der oxidierten Form des La-Proteins unterscheiden können. Unerwartet ist die Erkenntnis, dass sich offensichtlich zahlreiche B-Zellen mit anti-La-Spezifität von wenigen variablen Ketten ableiten und dass diese bei einer herkömmlichen Immunisierung entweder nicht aktiviert werden (und deshalb nicht in der Milz zu finden sind) oder sogar eliminiert werden. Der Import des La-Proteins in den Zellkern wird durch die klassischen Transportmoleküle Karyopherin-α und Karyopherin–β vermittelt. Für den Shuttlingprozess muss das Protein auch wieder aus dem Kern exportiert werden. Da es kontroverse Daten bezüglich eines Crm1-abhängigen Kernexports gab, wurde das Shuttlingverhalten von GFP-La-Fusionsproteinen in dieser Arbeit genauer analysiert. Mit Hilfe von Heterokaryonexperimenten konnte bestätigt werden, dass sowohl das hLa- als auch das mLa-Protein zwischen humanen und murinen Zellkernen pendeln kann und dass der Export unabhängig von Crm1 stattfindet. Aufgrund der kurzen Verweildauer im Zytoplasma schienen die Proteine quantitativ im Zellkern vorzuliegen, doch ein Teil konnte stets in den im Heterokaryon enthaltenen Nachbarzellkernen detektiert werden. Die Verwendung von N-terminal deletierten La-Fragmenten, die alle über das C-terminale NLS verfügten, gab Aufschluss über die Regulation des Shuttlings. Es zeigte sich, dass die Menge des exportierten Proteins von einem nukleären Retentionspartner festgelegt wird, der das La-Protein bindet und dadurch im Zellkern festhält. Wird diese Assoziation aufgehoben, gelangt das La-Protein in das Zytoplasma. Dort ist es allerdings nicht detektierbar, da das NLS einen umgehenden Import zurück in den Zellkern hervorruft. Zusätzlich wurde die Auswirkung von zellulärem Stress (z. B. durch ROS) auf die intrazelluläre Lokalisation des Proteins untersucht. Unter oxidativen zellulären Bedingungen wird einerseits die Wechselwirkung mit dem nukleären Retentionspartner aufgehoben und andererseits findet kein Kernimport über Karyopherin-α mehr statt. Aus diesem Grund reichert sich das La-Protein nun verstärkt im Zytoplasma an. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass das La-Protein von apoptotischen Zellen freigesetzt wird und daraufhin auf die Membran von Nachbarzellen binden kann. Die Bindungs-eigenschaften wurden mit rhLa-Protein genauer untersucht. Das La-Protein war auf Endothel- und Epithelzellen nachweisbar und die Bindung fand sowohl bei Inkubation auf Eis als auch bei 37 °C statt. Da das La-Protein auch über DNA-Bindungseigenschaften verfügt, war es in der Lage, DNA auf der Zelloberfläche zu immobilisieren. Innerhalb von PBMCs wurde es selektiv auf Antigen-präsentierenden Zellen nachgewiesen. Diese Eigenschaften lassen eine Beteiligung des Proteins bei der Induktion von anti-dsDNA-Antikörpern in Autoimmunpatienten vermuten. Es ist bekannt, dass die Bedingungen (Virusinfektion, UV-Exposition), die zur Translokation des La-Proteins auf die Zelloberfläche führen, bei SLE-Patienten Krankheitsschübe auslösen können. Bisher wurden anti-La-Autoantikörper aber eher nicht als pathophysiologisch erachtet, da sie bei der Bindung an bereits apoptotische Zellen keine weiteren Schäden verursachen können. Jedoch wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das La-Protein apoptotischer Zellen auf der Oberfläche von lebenden Zellen in der Umgebung nachgewiesen werden kann. Daran könnten anti-La-Autoantikörper binden und eine Komplement- oder NK-Zell-vermittelte Zerstörung der Nachbarzellen hervorrufen. Dadurch entstehen zusätzliche Gewebeschäden. Im Chromfreisetzungstest waren NK-Zellen tatsächlich in der Lage, La-dekorierte Zielzellen Antikörper-abhängig zu lysieren, sofern zusätzliche in vitro Stimuli präsent waren, die z. B. eine virale Infektion simulierten. Die Immuntherapie von Tumoren ist auf bestimmte Zielstrukturen auf den Tumorzellen angewiesen, über welche die Wirkstoffe spezifisch zu den maligne transformierten Zellen gebracht werden. Die Therapeutika, die sich oft von mAks gegen diese Zielstrukturen ableiten, müssen für verschiedene Tumorarten individuell entwickelt werden. Da das La-Protein von apoptotischen Zellen freigesetzt wird und auf die Membran benachbarter (bestrahlungsresistenter) Zellen binden kann, ist es in Kombination mit einer vorangegangenen Bestrahlung als universelle Zielstruktur für die Immuntherapie nutzbar. Aus diesem Grund wurde unter Verwendung eines ausführlich in dieser Arbeit charakterisierten anti-La-Antikörpers ein rekombinantes bispezifisches Antikörperderivat entwickelt. Es ist in der Lage, das La-Protein auf der Oberfläche von Tumorzellen zu binden und auf diesen zytotoxische T-Lymphozyten zu immobilisieren. Durch die Quervernetzung werden die T-Lymphozyten aktiviert und induzieren in den Zielzellen Apoptose. Das neue Antikörperderivat verspricht eine vielseitige Anwendung in Kombination mit Strahlentherapie oder auch mit rekombinanten Antikörpermolekülen, die gegen spezifische Zielstrukturen auf den Tumorzellen gerichtet sind.