Bielefeld, Univ., Diss., 2001. / Computerdatei im Fernzugriff.

Bielefeld, Univ., Diss., 2001. / Computerdatei im Fernzugriff.

Bayreuth, Universiẗat, Diss., 2003.

Bielefeld, Universiẗat, Diss., 2001.

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1967. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

L'hépatite C (VHC) est l'une des causes principales de maladies du foie dans le monde, qui représentent un risque élevé d'évoluer vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Actuellement, le traitement standard de l’infection par le VHC est l'interféron pégylé-(peg-IFN) et la ribavirine. Bien que le taux de la réponse virale soutenue (RVS) au traitement se soit améliorée au cours de ces années, cette thérapie n'est pas efficace chez tous les patients. En outre, plusieurs effets secondaires toxiques, de complications et le coût élevé limitent la compliance du patient et l'efficacité du traitement. Il n'existe pas de modèle simple d'infection par le VHC et il est nécessaire de développer des modèles in vitro et in vivo utiles pour étudier la physiopathologie de l'infection par le VHC, y compris les événements précoces de l'infection aiguë (l'entrée du virus, des mécanismes immunologiques et génétiques prédictifs) ainsi que l'évaluation de la puissance des médicaments antiviraux contre le VHC. Nous rapportons ici, nos efforts visant à développer des modèles appropriés de l'infection par le VHC. Dans un premier temps, nous avons établi un modèle de petit animal pour étudier l'infection par le VHC. Tupaia est un petit animal, apparenté aux primates et peu couteux. Dans notre travail, nous avons étudié la susceptibilité du tupaia à l'infection par VHC. Douze tupaias adultes ont été inoculés avec le VHC provenant de sérum de patient et d'ARN du VHC (génotype 1a). Trois jeunes tupaias ont été artificiellement nourris pendant un mois et ensuite inoculés par le VHC provenant de sérum du patient. L'ARN du VHC, les anticorps anti-VHC et l’évolution des quasi-espèces du VHC ont été déterminées chez l'animal avant et après l'inoculation. L'infection transitoire et intermittente s'est produite chez deux des 3 jeunes tupaias et l’infection chronique par le VHC s’est produite chez quatre tupaias sur 12 tupaias adultes. Le tupaia devrait représenter un modèle utile pour l'étude de l’infection chronique par le VHC. Dans une deuxième étape, un système de culture in vitro d'hépatocytes primaires de Tupaia a été établi, dans lequel l'infection par le VHC ne pouvait être bloquée ni par le CD81 soluble ni par des anticorps dirigés contre le CD81. Pour comprendre ces résultats, nous avons cloné, séquencé la grande boucle extracellulaire (LEL) du CD81 chez le Tupaia et analysé l'interaction de la protéine d’enveloppe E2 du VHC avec la LEL du CD81 chez le Tupaia par un test « enzyme-linked immunosorbent assay » (EIA). Nous avons constaté que chez le Tupaia, la séquence d'acides aminés du LEL de CD81 qui se lie au VHC présentait en 6 résidus d'acides aminés différents par rapport à la séquence humaine et la capacité de LEL de CD81 à se lier à la proteine d’enveloppe E2 du VHC a également diminuée. La structure différente de CD81 chez l’homme et chez le tupaia pourrait expliquer l'altération de l'interaction entre CD81 et la proteine E2 du VHC. Ce résultat démontre un rôle important de LEL du CD81 pour l'entrée du VHC. Dans une troisième étape, nous avons développé un modèle ex vivo de culture de tranches de foie humain et leur infection par le VHC. Le développement de lignées cellulaires provenant d’hepatocarcinome, permissives à la réplication du VHC, a fourni d'importants nouveaux outils virologiques pour étudier les mécanismes de l'infection par le VHC, mais ce modèle expérimental reste relativement éloigné des conditions physiologiques et pathologiques. Nous rapportons ici le développement d'un nouveau modèle ex vivo utilisant la culture de tranches de foie humain adulte, démontrant, pour la première fois, la capacité d’isolats primaires ainsi que JFH -1, H77/C3, Con1/C3 (HCVcc), de répliquer et de produire de novo des particules virales infectieuses ayant un titre viral élevé… / Hepatitis C virus (HCV) is one of the major causes of liver disease all over the world which has a high risk to progress to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Currently, the licensed standard treatment of HCV infection is Pegylated-interferon (peg-IFN) and ribavirin. Although the sustained viral response (SVR) rate of treatment has improved during these years, this therapy is not effective in all patients. In addition, several toxic side effects, complication and high cost limit the patient compliance and the efficacy of the treatment. There is no easy model of HCV infection and it is necessary to develop useful in vitro and in vivo models to study the pathobiology of HCV infection, including early events of acute infection (viral entry, immunological mechanisms, and genetic predictors) as well as the evaluation of the potency of the HCV antiviral drugs. We report here in our efforts in developing suitable models of HCV infection. In a first step, we preliminary established a small animal model to study HCV infection. Tupaia is a small, closed related to primate and cost-effective animal. In our work, we investigated the susceptibly of tupaia to HCV infection. Twelve adult tupaias were inoculated with native HCV from patient serum and full-length HCV RNA (Genotype 1a). Three young tupaias were artificially breeded for a month and then inoculated by native HCV from patient serum. HCV RNA, anti-HCV and HCV quasi species evolution were determined in the animal before and after inoculation. Transient and intermittent infection occurred in two among 3 young tupaias and HCV chronic infection occurred in four among 12 adult tupaias. Tupaia should represent a useful model for study HCV chronic infection. In a second step, an in vitro culture system of primary tupaia hepatocytes has been established in which HCV infection could be blocked neither by the soluble CD81 nor by antibodies against CD81. To understand these results, we cloned, sequenced the large extracellular loop (LEL) of tupaia CD81 and analyzed the interaction of HCV E2 with the tupaia CD81 LEL by enzyme-linked immunosorbent assay (EIA). We found that in the tupaia the amino acids sequence of HCV CD81 LEL presented in 6 different amino acid residues compared with human CD81 LEL sequence and the CD81 LEL ability to bind to HCV E2 was also decreased. The different structure of CD81 between human and tupaia could explain the alteration of the interaction between HCV E2 and CD81. This result demonstrated an important role of CD81 LEL for HCV entry. In a third step, we developed an ex vivo model of human liver slices culture and their infection with HCV. The development of human cultured HCV-replication-permissive hepatocarcinoma cell lines has provided important new virological tools to study the mechanisms of HCV infection; however this experimental model remains distantly related to physiological and pathological conditions. Here, we report the development of a new ex vivo model using human adult liver slices culture, demonstrating, for the first time, the ability of primary isolates to undergo de novo viral replication with the production of high titer infectious virus, as well as JFH-1, H77/C3, Con1/C3 (HCVcc). This experimental model was validated by demonstrating the HCV neutralization or HCV inhibition, in a dose-dependent manner, either by CD81 or E2 specific antibodies or convalescent serum from a recovered HCV patient, or by anti-viral drugs. This new ex vivo model represents a powerful tool for studying the viral life cycle, dynamics of virus spread in the liver and also for evaluating the efficacy of the new antiviral drugs. In the last step, we evaluated the efficacy of the new antiviral drugs with our ex vivo model of human adult liver slices. HCV NS3/4A protease is essential for viral replication and has been one of the most important target for developing specific antiviral drug

Charakterisierung neuraler Vorläuferzellen im pränatalen Neokortex des Nördlichen Spitzhörnchens (Tupaia belangeri) Einleitung: Im Verlauf der Evolution entwickelte sich der Neokortex zum komplexesten Anteil des Säugetiergehirns. Ausdifferenzierungen und eine immense Expansion des Neo-kortex, vor allem in der Primatenabstammungslinie, waren die Folge. Der größte Teil der neokortikalen Neurone wird während der Embryonal- und Fetalphase gebildet und stammt von sogenannten neuralen Stamm- und Progenitorzellen (NPCs) ab. Diese entstehen in zwei unterschiedlichen Keimschichten, der Ventrikulärzone (VZ) und der Subventrikulärzone (SVZ). Vorangegangene Studien zeigten, dass sich die Dicke der SVZ als auch das Vorhan-densein und die Häufigkeit bestimmter NPCs, besonders die der basalen radialen Gliazelle (bRG), zwischen lissenzephalen Nagetieren und gyrenzephalen Primaten erheblich unter-scheidet. Bislang werden überwiegend Nagetiere in Untersuchungen zu gehirnassoziierten Fragestellungen eingesetzt, wohlwissentlich dass es deutliche Unterschiede in der neokorti-kalen Entwicklung (d.h. in der Abundanz und Verteilung der unterschiedlichen NPCs) zwi-schen Mensch und Nagetier gibt. Die Etablierung eines Tiermodells, das eine ähnliche NPC- Ausstattung wie der Mensch besitzt, ist für das bessere Verständnis der humanen Neokorte-xentwicklung sowie neokortikaler Entwicklungsstörungen und Erkrankungen essenziell. Das nördliche Spitzhörnchen (Tupaia belangeri) ist ein rattengroßes Tier mit einem hohen Ge-hirn-Körpermasse-Verhältnis und steht phylogenetisch zwischen den Nagetieren und den Primaten. Ziel der Untersuchung: Ziel dieser Arbeit war es, die Präsenz, die Abundanz und die Ver-teilung der bRGs und anderer NPCs in den Keimzonen (VZ und SVZ) des sich entwickeln-den Neokortex des Tupaia belangeri zu erfassen. Die erhobenen Daten wurden mit vorhan-denen Daten von Makaken, Frettchen, Ratte und Maus verglichen, um zu erfahren, ob Schlüsselmerkmale der Neokortexentwicklung größere Gemeinsamkeiten zu gyrenzepha-len Primaten oder lissenzephalen Nagetieren zeigen. Tiere, Material und Methoden: Die Tupaiagehirne stammen von Tieren aus dem Institut für Biologie der Universität Leipzig, Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psycho-logie und dem Institut für Zoologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Das Alter der Proben bewegte sich von Embryonaltag 32 (n=2), 37 (n=2), 45 (n=2) bis hin zu Postnataltag (P) 1 (n=2). Die exakte Bestimmung des Alters der Tiere erfolgte über eine Scheitel-Steißlängen-Wachstumskurve. Die Gehirne wurden entnommen, fixiert und das gesamte Telenzephalon wurde von rostral nach kaudal in Einzelschnitte von 30 µm Dicke geschnitten und immunhistochemisch gefärbt. Dabei wurden fluoreszenmarkierte sekundäre Antikörper verwendet. Die visuelle Darstellung erfolgte mittels eines konfokalen Lasermikroskops (Leica SP8). Die Aufnahmen wurden mittels Fiji und Adobe Photoshop Software prozessiert. Die Quantifizierung der Zellen erfolgte mittels Fiji Software (Multiclass Cell Counter plug in). Die statistische Auswertung erfolgte durch R Software. Im Rahmen einer Ranganalyse wurden nichttransformierte Werte verschiedener neokortikaler Parameter unterschiedlicher Spezies verglichen und mit dem Kruskal-Wallis-Test mit anschließendem Conover post-hoc-Test auf eine statistische Signifikanz (p <0.05) geprüft. Darüber hinaus wurde nach Standardisierung mittels z-Score eine Hauptkomponentenanalyse, euklidische Distanzberechnung und hierar-chisches Clustern durchgeführt. Ergebnisse: Drei grundlegende Erkenntnisse stellen sich dar. Der sich entwickelnde Neo-kortex des Tupaia belangeri verfügt über (i) eine relativ große SVZ, (ii) eine hohe Abundanz von Pax6+ NPCs in der SVZ sowie über (iii) einen hohen Prozentsatz von bRGs zum Zeit-punkt der Bildung der oberen Kortexschichten. Durch die statistische Auswertung stellte sich heraus, dass bestimmte Schlüsselmerkmale in der Neokortexentstehung des Tupaia (d.h. Entwicklung der Keimzonen, Verteilung und Abundanz von unterschiedlichen NPCs) größe-re Ähnlichkeiten zu denen der gyrenzephalen Primaten als zu denen der lissenzephalen Na-getiere aufweisen. Beim Rangvergleich der untersuchten Parameter wurde eine statistische Signifikanz (siehe Tiere, Material und Methoden mit p <0.05) festgestellt. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass große Ähnlichkeiten zwischen den NPC Populationen im sich entwickelnden Neokortex von gyrenzephalen Primaten und Tupaia belangeri bestehen. Somit wird mit dem Tupaia belangeri der biomedizinischen For-schung und translationalen Medizin für die Untersuchung von entwicklungsbedingten Fehl-bildungen und Erkrankungen des Neokortex ein besonders geeignetes Tiermodell - als Al-ternative zu Maus, Ratte, Frettchen und Primaten - zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus bieten die gewonnenen Ergebnisse weitreichende Einsichten in die Evolution des Gehirns und die Phylogenese der NPCs der Säugetiere und sind somit für die Grundlagenforschung von großer Bedeutung.

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