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Caracterização bioquímica e celular da proteína TRIM49 / Biochemical and cellular characterization of the TRIM49 proteinGuimarães, Dimitrius Santiago Passos Simões Fróes 10 August 2017 (has links)
A autofagia é o processo de degradação de estruturas celulares através do seu direcionamento ao lisossomo. As proteínas TRIMs reconhecem as -cargas? autofágicas e reúnem o complexo de nucleação do fagóforo, contudo se desconhece a função de cada domínio e a importância da atividade de E3 ligase para a sua atividade. A proteína TRIM49 clonada e expressa em E. coli ou em células humanas HEK293T não apresentou atividade de E3 ubiquitina ligase in vitro e reduziu os níveis totais de ubiquitinação in vivo, indicando que não é um E3 ubiquitina ligase. Células desafiadas com Htt74Q apresentaram menores níveis de citotoxicidade quando co-transfectadas com TRIM49 selvagem, mas não com os mutantes do domínio RING ou SPRY, indicando os dois domínios são necessários para sua atividade celular. A proteína selvagem se colocaliza com o marcador autofágico LC3, após o bloqueio da autofagia com bafilomicina A1. Os resultados indicam que a TRIM49 pode atuar na degradação intracelular de proteínas, por um mecanismo não dependente de atividade de E3 ligase. / Autophagy is the process of degradation of intracellular proteins through their directioning to the lysosome. TRIM proteins can directely recognize autophagic cargo and also act as a hub for the phagophore nucleation complex, however the function of each domain and the role of the E3 ligase activity in this process is unknown. The TRIM49 protein cloned and expressed in E. coli or in human cells HEK23T showed no ubiquitin E3 ligase activity in vitro and cells transfected with the wild type protein showed lower levels of polyubiquitinated proteins, indicating that TRIM49 is not a bona fide E3 ubiquitin ligase. Cells challenged with Htt74Q presented lower cytotoxicity levels when cotransfected with wild type TRIM49, when compared with the RING domain mutant or with the truncated protein lacking the SPRY domain, indicating that both domains are required for its cellular activity. The wild type protein colocalizes with the autophagic marker LC3 after treatment with the autophagy inhibitor bafilomycin A1. Taken together, these results indicate that the TRIM49 protein plays a role in protein degradation independently of a E3 ligase activity.
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Caracterização bioquímica e celular da proteína TRIM49 / Biochemical and cellular characterization of the TRIM49 proteinDimitrius Santiago Passos Simões Fróes Guimarães 10 August 2017 (has links)
A autofagia é o processo de degradação de estruturas celulares através do seu direcionamento ao lisossomo. As proteínas TRIMs reconhecem as -cargas? autofágicas e reúnem o complexo de nucleação do fagóforo, contudo se desconhece a função de cada domínio e a importância da atividade de E3 ligase para a sua atividade. A proteína TRIM49 clonada e expressa em E. coli ou em células humanas HEK293T não apresentou atividade de E3 ubiquitina ligase in vitro e reduziu os níveis totais de ubiquitinação in vivo, indicando que não é um E3 ubiquitina ligase. Células desafiadas com Htt74Q apresentaram menores níveis de citotoxicidade quando co-transfectadas com TRIM49 selvagem, mas não com os mutantes do domínio RING ou SPRY, indicando os dois domínios são necessários para sua atividade celular. A proteína selvagem se colocaliza com o marcador autofágico LC3, após o bloqueio da autofagia com bafilomicina A1. Os resultados indicam que a TRIM49 pode atuar na degradação intracelular de proteínas, por um mecanismo não dependente de atividade de E3 ligase. / Autophagy is the process of degradation of intracellular proteins through their directioning to the lysosome. TRIM proteins can directely recognize autophagic cargo and also act as a hub for the phagophore nucleation complex, however the function of each domain and the role of the E3 ligase activity in this process is unknown. The TRIM49 protein cloned and expressed in E. coli or in human cells HEK23T showed no ubiquitin E3 ligase activity in vitro and cells transfected with the wild type protein showed lower levels of polyubiquitinated proteins, indicating that TRIM49 is not a bona fide E3 ubiquitin ligase. Cells challenged with Htt74Q presented lower cytotoxicity levels when cotransfected with wild type TRIM49, when compared with the RING domain mutant or with the truncated protein lacking the SPRY domain, indicating that both domains are required for its cellular activity. The wild type protein colocalizes with the autophagic marker LC3 after treatment with the autophagy inhibitor bafilomycin A1. Taken together, these results indicate that the TRIM49 protein plays a role in protein degradation independently of a E3 ligase activity.
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Estudos funcionais e estruturais da proteína recombinante humana UBE2G2 (Ubiquitin-conjugating enzyme E2G2).Reyes, Luis Fernando 10 June 2005 (has links)
Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2005-06-10 / Financiadora de Estudos e Projetos / The ubiquitin system represents a selective mechanism for intracellular
proteolysis in eukaryotic cells that involves the sequential activity of three
enzymes, E1 (Ubiquitin activating enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating
enzyme), and E3 (Ubiquitin-protein ligase). The identification of these
proteins and their targets as well as structural data is essential to
understand their function in the eukaryotic cell. In the present study the
open reading frame of human Ubiquitin- conjugating enzyme UBE2G2 was
isolated from a human brain cDNA panel, cloned into pET28 vector and
expressed in Escherichia coli. His-tagged protein was then purified by
nickel-affinity chromatography and subjected to structural and functional
studies using circular dichroism (CD) and an in vitro ubiquitin-binding
assay, respectively. The affinity chromatography assay rendered
approximately the 27 mg of the soluble recombinant HisUBE2G2 after
expressed in bacteria at low amounts of IPTG (0,1mM) in 3 hours of
induction. The CD spectra of recombinant pure protein showed a secondary
structure content according with the expected for a member of the E2 family
(Ubiquitin-conjugating enzyme), with 35 % of α-Helix, 21 % of β sheets and
23 % of turns. Moreover, purified protein was able to bind ubiquitin
molecules when mixed with a HeLa cell extract during the pull-down assay.
Taken together the results presented in this work allow inferring that
HisUBE2G2 was expressed in their active form. / O Sistema de Ubiquitinação representa o mecanismo de degradação
protéica intracelular mais importantes em todos nas células eucarióticas e
envolve a atividade seqüencial de três enzimas conhecidas como E1, enzima
ativadora de ubiquitina, a E2 enzima conjugante de ubiquitina e a E3 enzima
ligante de ubiquitina. A identificação destas proteínas e seus alvos protéicos,
assim como as obtenções de dados estruturais são essenciais para entender a
função deste sistema dentro da célula eucariótica. No presente trabalho, a fase
de leitura aberta (ORF) do gene humano ube2g2 foi isolado de um painel de
cDNA de cérebro humano, foi clonado no vetor pET28a e expressado em
bactérias Escherichia coli. A proteína de 18,5 kDa em fusão com uma cauda de
histidinas foi posteriormente purificada por cromatografia de afinidade e
submetido a ensaios estruturais e funcionais a traves do medição do CD e a
traves do ensaio de pull-down, respectivamente. A cromatografia de afinidade
rendeu 27 mg de proteína solúvel, logo após de tê-la expressado
heterologamente a baixas concentrações de indutor IPTG 0,1 mM em três horas
de indução. O espectro de CD da proteína purificada mostrou o conteúdo de
estrutura secundaria de acordo ao esperado para um membro típico da família
de enzimas E2, apresentando um 35 % de hélices α, 21 % de folhas β e 23 % de
giros. Alem do mais, a proteína purificada foi capaz de ligar molécula de
ubiquitina quando misturada com um extrato de células HeLa, durante o
ensaio de pull-down. Desta maneira e com esses resultados apresentados aqui
pode se inferir que a proteína humana UBE2G2 foi expressa na sua forma
ativa.
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O gene UBE2A (Ubiquitin conjugating enzyme 2 A) e a deficiência mental: triagem de mutações e estudos funcionais / UBE2A (Ubiquitin conjugating enzyme 2 A) gene and mental retardation: search for mutations and functional studiesNascimento, Rafaella Maria Pessutti 06 August 2010 (has links)
Em trabalho anterior, identificamos a mutação c.382C8594;T no gene UBE2A, localizado em Xq24 e codificador de enzima conjugadora de ubiquitina, como causa de nova síndrome de deficiência mental (DM) de herança ligada ao cromossomo X. Foi a primeira descrição de mutação nesse gene e a primeira associação de mutação em gene que codifica conjugase de ubiquitina com patologia humana. Neste trabalho, focalizamos o gene UBE2A quanto a expressão dos transcritos alternativos, função das isoformas por eles codificadas e o efeito da mutação c.382C 8594; T como causa de deficiência mental (DM). No Capítulo I, revisamos os aspectos genéticos da DM, dando ênfase à herança ligada ao cromossomo X, principal causa de DM herdada e resumimos o estudo que levou à identificação da mutação em UBE2A como causa de quadro sindrômico de DM. Revisamos o papel da via de ubiquitinação de proteínas e das enzimas que participam do processo, em especial as conjugases de ubiquitina. Levantamos evidências na literatura que não deixam dúvida sobre a importância da via de ubiquitinação no sistema nervoso, tanto em processos de neurodesenvolvimento como neurodegeneração. No Capítulo II, avaliamos a contribuição de mutações em UBE2A como causa de DM. Apresentamos os resultados do sequenciamento direto da região codificadora do gene UBE2A em afetados de 23 famílias em que a DM segrega ligada à segmento que inclui Xq24, onde está localizado o gene UBE2A. Uma dessas famílias foi averiguada no Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociência, USP (LGH-IB/USP), coordenado pelo Dr. Paulo A. Otto e pela Dra. Angela Vianna Morgante. As demais 22 famílias pertencem ao banco de amostras do Consórcio Europeu de Deficiência Mental (European Mental Retardation Consortium EURO-MRX). A triagem foi também realizada em um indivíduo afetado por DM sindrômica que compartilha características clínicas com nossos pacientes. Como acontece com a maioria dos genes do cromossomo X, o gene UBE2A não parece ser responsável por parcela significativa dos casos de DM, já que novas mutações em UBE2A não foram detectadas nessa triagem. Avaliamos o efeito da mutação c.382C 8594; T nos níveis da transcrição e da tradução em homem afetado e em mulher portadora. A presença da mutação que leva a um códon de parada prematura não resultou na degradação do RNA, que detectamos nas células do afetado. Já na mulher portadora, apenas o transcrito normal foi detectado, de acordo com nossos dados anteriores que mostraram desvio completo no padrão de inativação do cromossomo X nas portadoras da mutação, tendo um mesmo cromossomo X ativo nas células do sangue. A vantagem proliferativa das células em que o cromossomo X com alelo mutado estava inativo deve ter levado a esse padrão de inativação desviado do casual, evidenciando o efeito deletério da mutação. Entretanto, o mecanismo pelo qual a mutação afeta a via de UBE2A permanece interrogado. A proteína UBE2A alterada foi encontrada em baixa quantidade nas células do paciente, o que pode ser o resultado de síntese prejudicada ou de degradação pós-traducão. Independente do mecanismo responsável, o fato de apenas uma pequena quantidade da proteína mutada ter sido encontrada, nos permite afirmar que, nas células desses indivíduos, há perda de função de UBE2A. Devemos, contudo, considerar que a proteína mutada é sintetizada e que, no caso de a menor quantidade dever-se à degradação pós-tradução, esse processo pode prejudicar a homeostase celular e contribuir para o quadro clínico. O capítulo II focaliza os transcritos alternativos de UBE2A. Diversos bancos de dados apontam para a existência de três transcritos alternativos do gene UBE2A humano, mas não há trabalho científico que caracterize os tecidos em que os transcritos são expressos ou a função das proteínas por eles codificadas. A mutação c.382C 8594; T localiza-se no éxon 6 do gene, comum a todos os transcritos, de forma que, no caso de eles codificarem proteínas funcionais, a mutação comprometeria três proteínas, e não apenas uma. Demonstramos que os três transcritos de UBE2A são xpressos em leucócitos, pré-adipócitos, placenta, córtex cerebral e hipocampo humanos. Detectamos também os três transcritos nas células de sangue e pré-adipócitos de um de nossos pacientes portador da mutação c.382C 8594; T. Embora os bancos de dados apontem para a existência de apenas um transcrito de UBE2A em camundongos, identificamos um transcrito alternativo correspondente ao transcrito alternativo 3 humano. Este foi detectado inclusive em camundongos nocaute quanto ao gene UBE2A o processo de geração do animal nocaute foi realizado por recombinação homóloga em que o cassete de neomicina foi inserido no éxon 1 do gene, de maneira que não eliminou a existência do transcrito correspondente ao transcrito 3 humano, que utiliza uma 5 UTR alternativa localizada no íntron 3. Entretanto, as proteínas codificadas pelos transcritos alternativos não foram detectadas nos extratos protéicos analisados humanos e de camundongo. Esse resultado poderia ser explicado pela falta de especificidade do anticorpo utilizado ou por essas isoformas representarem pequena parcela do pool de proteínas da célula. Os anticorpos comerciais anti-RAD6 e anti-HR6A/HR6B foram produzidos após imunização de coelhos com a porção N-terminal da isoforma 1. Seria, portanto, possível que não fossem capazes de detectar as isoformas 2 e 3, em que o segmento utilizado para a produção dos anticorpos está total ou parcialmente ausente. No caso de as proteínas estarem pouco representadas na célula, experimentos de co-imunoprecipitação auxiliariam na identificação dessas isoformas nos extratos protéicos. Entretanto, para a detecção de todas as isoformas de UBE2A seria necessário anticorpo que reconhecesse a porção C-terminal de UBE2A. Em 2009, duas novas mutações em UBE2A foram descritas em estudo colaborativo realizado no Welcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, Reino Unido, após sequenciamento em larga escala de aproximadamente 700 genes do cromossomo X de cerca de 200 indivíduos com DM de herança ligada ao X. Ambas as mutações c.215C 8594; T e c.328C 8594; G eram do tipo missense. Não foram fornecidas informações quanto ao quadro clínico dos portadores dessas mutações e também não foi esclarecido porque apenas a alteração c.215C 8594; T que resulta na troca do resíduo de fenilalanina da posição 72 por um resíduo de serina (F72S) foi considerada pelos autores como possivelmente patogênica. Nossos estudos in vitro, apresentados no Capítulo III, sugerem que ambas as alterações afetam a função de UBE2A. Em 2010, foram publicados dois trabalhos associando novas alterações em UBE2A a quadro de DM. Honda e col. (2010) descreveram uma microdeleção em Xq24 que inclui UBE2A e outros oito genes, em um menino com DM e características também presentes em nossos pacientes. Budny e col. (2010) descreveram mutações missense em UBE2A em duas famílias em que segregava quadro de DM sindrômica semelhante ao de nossos pacientes. Por comunicação pessoal de Arjan de Brouwer (Departamento de Genética Humana da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda), soubemos da existência de três outras microdeleções de segmentos do cromossomo X que incluem UBE2A, em pacientes do sexo masculino, não aparentados. Comparamos as características clínicas de nossos pacientes com as dos portadores das microdeleções em Xq24 e com aquelas dos portadores de mutações missense em UBE2A. A DM grave e o comprometimento significativo ou ausência de fala são comuns a todos. Outras características como baixa estatura, sinófris, boca grande e lábios finos com comissuras voltadas para baixo, pescoço curto e largo, implantação baixa de cabelos na nuca, mamilos espaçados, pênis pequeno, hirsutismo generalizado e a ocorrência de convulsões parecem predominar. Entretanto, enquanto a microcefalia aparece em dois dos três portadores de microdeleções avaliados, a macrocefalia parece predominar no grupo em que ocorrem as mutações de ponto. No Capítulo III, abordamos estudos funcionais in vivo e in vitro para avaliar se as isoformas alternativas de UBE2A compartilham suas funções de conjugase de ubiquitina e compreender o efeito da mutação c.382C8594;T na função de UBE2A. Buscamos estabelecer modelo celular para avaliar o efeito da mutação na formação de neuritos. Trabalho previamente publicado havia demonstrado que a diferenciação neuronal de células PC12 concomitantemente com a inibição parcial do mRNA de UBE2B (parálogo de UBE2A) resultava na redução de 20-30% do comprimento de neuritos. Entretanto, nossos ensaios de diferenciação de pré-adipócitos não responderam nossas questões sobre o efeito da mutação na formação de neuritos, pois não conseguimos obter, nas células do controle ou nas do paciente, a densidade de neuritos descrita anteriormente na diferenciação de pré-adipócitos. Diferentemente das células PC12, de origem ectodérmica, os pré-adipócitos tem origem mesodérmica, o que dificulta sua diferenciação em linhagem derivada de outro folheto germinativo. A elevada conservação entre as proteínas ortólogas UBE2A e UBE2B humanas e RAD6 de levedura e a observação de que ambas as parálogas humanas são capazes de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de Saccharomyces cerevisiae nos levou a considerar a linhagem de levedura 916;rad6 como modelo para nossos estudos funcionais. Também, avaliamos a capacidade das isoformas 2 e 3 e da isoforma Q128X de UBE2A para ubiquitinar histonas H2A in vitro, conforme previamente descrito para a isoforma UBE2A/1. Os resultados dos ensaios in vivo indicam que apenas a expressão do transcito 1 de UBE2A é capaz de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de S. cerevisiae. A expressão dos transcritos 2 ou 3 não resulta na restituição do fenótipo de sensibilidade à UV - a expressão gera certa toxicidade, agravada quando as células são cultivadas a 37o C. Entretanto, as isoformas por eles codificadas não parecem ser estáveis na levedura: assim como nos tecidos humanos testados, não conseguimos detectá-las nos extratos protéicos das leveduras que expressavam esses transcritos. A expressão do transcrito 1 contendo a mutação c.382CT revelou que a isoforma UBE2A/Q128X, por sua vez, é estável na linhagem 916;rad6, porém, além de não restituir o fenótipo de sensibilidade à UV, foi, dentre as isoformas de UBE2A, a mais tóxica. Os fenótipos de toxicidade não foram observados após expressão em linhagem selvagem de S. cerevisiae. Esses resultados indicam que as isoformas 2 e 3 de UBE2A não apresentam atividade de conjugase de ubiquitina e que são, aparentemente, degradadas imediatamente após sua expressão em levedura. O fato de o fenótipo de toxicidade ser agravado, em condições de choque térmico, apóia a hipótese de degradação dessas isoformas, em levedura. A degradação pode ser resultado da ausência de parceiro que permita sua estabilidade, mas a ausência das isoformas também em extratos protéicos de tecidos humanos sugere que o mesmo processo de degradação ocorra em mamíferos. Segundo a classificação das E2, as diversas conjugases de ubiquitina têm em comum o domínio UBC altamente conservado e as variações observadas consistem em inserções ou extensões C-terminais, mas nunca deleções, como ocorre nas isoformas 2 e 3 de UBE2A. Os transcritos alternativos teriam, assim, função regulatória. Os ensaios in vitro confirmaram a capacidade de UBE2A/1 ubiquitinar histonas H2A. Os ensaios com UBE2A/2 e UBE2A/3 não foram conclusivos, uma vez que a incapacidade de ubiquitinação de histonas que observamos pode ter consequência da renaturação in vitro, que pode ter ocorrido prejudicando sua função. Entretanto a obtenção das isoformas puras nos permitiu verificar que, caso a isoforma 2 estivesse presente nos extratos de levedura, ela seria reconhecida pelo anticorpo anti-RAD6. Verificamos que a proteína mutada UBE2A/Q128X é capaz de interagir com a E1, da qual recebe a molécula de ubiquitina, mas não é capaz de transferi-la para a histona. O segmento C-terminal ausente nessa isoforma é, portanto, importante nesse processo. Os ensaios in vitro despertaram nossa atenção para o fenômeno de autoubiquitinação de UBE2A, possível mecanismo de autorregulação previamente considerado na literatura. O fato de alguns trabalhos sugerirem que as E2 atuem também como dímeros in vivo e in vitro e a elevada conservação entre as parálogas humanas UBE2A e UBE2B nos levaram a considerar a possibilidade de mecanismo de regulação recíproca. Dessa maneira, a degradação de UBE2A/Q128X nas células do paciente poderia ser dependente de UBE2B. A reduzida capacidade de autoubiquitinação da isoforma mutada dificultaria sua degradação e tornaria necessária a atividade da paráloga. Isso explicaria porque ela é estável quando expressa na linhagem de levedura 916;rad6, mas não nas células do paciente. A presença de RAD6 estaria diretamente relacionada à ausência de toxicidade após a expressão de UBE2A/Q128X em linhagem selvagem a degradação da isoforma mutada está ocorrendo nessas células. A não viabilidade de camundongo duplo-nocaute quanto as parálogas UBE2A e UBE2B não permite testar a estabilidade da isoforma mutada em células de mamíferos. Observamos, de fato, que a inibição do proteassoma nas células do paciente leva ao acúmulo dessa proteína. A presença da mutação c.382C8594;T nas células do paciente parece resultar no fenótipo de DM devido à perda de função de UBE2A: a isoforma mutada não restitui o fenótipo de sensibilidade à UV de S. cerevisiae e não foi capaz de ubiquitinar histonas H2A in vitro. Além disso, indivíduos com microdeleções de UBE2A apresentam fenótipo semelhante ao de nossos pacientes. Por outro lado, a presença da proteína mutada que necessitaria de UBE2B para ser degradada pode caracterizar um ganho tóxico de função - comprometeria a função de ambas as parálogas. É possível que os dois mecanismos contribuam para o quadro clínico. Os dados dos ensaios in vivo e in vitro abrem caminhos de investigação do processo de regulação de UBE2A e UBE2B no nível da proteína, sugerindo a autoubiquitinação e a ubiquitinaão recíproca como possíveis mecanismos reguladores, que podem explicar a conservação das duas parálogas de RAD6 em mamíferos. / We have previously described a nonsense mutation (c.382C8594;T) in the UBE2A gene, at Xq24, which encodes a ubiquitin conjugating enzyme (E2), as the cause of a new X-linked mental retardation syndrome. The predicted protein lacks the 25 C-terminal amino acid residues conserved in vertebrates and in Drosophila. This was the first description of a mutation in a ubiquitin conjugating enzyme gene causative of a human disease. In the present work, we focused on the UBE2A gene, its alternative transcripts and isoforms, and the effect of the c.382C8594;T mutation. We screened for UBE2A mutations 23 males presenting X-linked mental retardation (XLMR), previously mapped to the interval encompassing this gene, and one isolated case, who shared clinical features with our previously described patients. No mutations were detected in this selected series of patients suggesting that mutations in UBE2A is not a common cause of XLMR, similarly to the majority of the XLMR genes hereto described. Very recently four Xq24 microdeletions encompassing UBE2A and three missence mutations were found by other groups in mentally retarded males that shared several clinical features with our patients. Comparing these and our patients, a clinical picture emerges of mental retardation associated with severe speech impairment, present in all of them. Short stature, large mouth with downturned corners and thin lips, short and broad neck, low posterior hairline, widely spaced nipples, marked generalized hirsutism and seizures are common features. However, microcephaly was observed only in patients carrying UBE2A deletions, while carriers of missense or nonsense mutations showed macrocephaly. We evaluated the effect of the UBE2A c.382C8594;T mutation on transcription and translation. This mutation affects the last UBE2A exon and, as expected, does not lead to nonsense mediated RNA decay, demonstrated by the presence of UBE2A mRNA in leucocytes of an affected male. However, only a small amount of the mutated protein was detected in the patients cells, suggesting the loss of UBE2A function as the cause of the syndrome. The posttranslational degradation of the mutated protein could also disturb the cellular homeostasis, a gain of function that remained a possibility. The detrimental effect of the c.382C8594;T mutation was further supported by the presence of only the normal transcript in leucocytes of a heterozygous woman, who had completely skewed X inactivation, thus pointing to the selective advantage of lymphocytes carrying the normal allele on the active X chromosome. Our search in DNA and protein sequence databases suggested that the UBE2A gene produces three alternative transcripts all classified as protein coding. These three tanscripts contain the mutation site (c.382C8594;T). We showed that all three UBE2A transcripts are expressed in human leucocytes, adipocytes, placenta, cerebral cortex and hippocampus. We also detected an alternative transcript in murine, which corresponds to the human transcript 3. This alternative transcript was present in all murine tissues analyzed, including samples from a UBE2A knockout mouse. However, we failed to detect the proteins encoded by the alternative transcripts. This could result from low affinity of the used commercial antibody to the isoforms. Alternatively, a small amount of these proteins in the pool of cellular proteins, might have not been detected by Western blotting. We performed in vivo and in vitro assays to address the role of the alternative UBE2A isoforms, and to evaluate the effect of c.382C-T mutation on UBE2A function. Taking into account the high amino acid conservation between the human UBE2A and the Saccharomyces cerevisiae ortholog RAD6, we used a 916;rad6 yeast strain to verify whether UBE2A alternative and mutated isoforms were able to complement its UV-sensitivity phenotype, as previously demosntrated for UBE2A isoform 1. We also performed in vitro assays to evaluate their ubiquitination activity towards histone H2A, a known in vitro substrate of RAD6 and UBE2A. Only UBE2A isoform 1 could rescue the UV sensitivity phenotype of the knockout yeast strain. The expression of the alternative isoforms 2 and 3 was partially toxic to this yeast strain, and toxicity increased under heat shock conditions. However, these two isoforms do not seem to be stable in yeast cells: as in human tissues, we failed to detect UBE2A isoforms 2 and 3 in yeast cells expressing the corresponding transcripts. The mutant isoform was stable in yeast, but was unable to rescue the UV-sensitivity phenotype, its expression resulting in severe toxicity to the 916;rad6 strain. On the other hand, toxicity was not observed when the mutant UBE2A isoform was expressed in wild type yeast. These findings suggest that isoforms 2 and 3 do not have ubiquitin conjugating activity and, apparently, are degraded immediately after translation. The fact that toxicity is enhanced when these isoforms are expressed under heat shock conditions supports Degradation hypothesis. The degradation could also be due to the absence of a functional partner, in yeast, that could contribute to their stability. Since the alternative isoforms were not detected in the human tissues analyzed, the degradation might occur in human cells as well. E2 enzymes share a catalytic domain and variations among them consist of insertions or terminal extensions, never deletions. Both isoforms 2 and 3 would have deletions of the catalytic domain, suggesting that they are not functional. A regulatory role for these transcripts is a possibility. Our in vitro assays confirmed that UBE2A isoform 1 is capable of histone H2A ubiquitination. The assays for isoforms 2 and 3 were inconclusive, since their lack of ubiquitin conjugating activity could be caused by incorrect in vitro refolding, required because the proteins were obtained from bacterial inclusion bodies after heterologous expression. The mutated protein, however, was able to interact with the ubiquitin molecule, but failed to transfer it to histones, thus pointing to the importance of the C-terminal segment in this process. Our in vitro assays stongly suggested that UBE2A autoubiquitination occur, an activity previously considered a possible E2 regulatory mechanism. Since there is evidence that some E2s form functional dimers, we hypothesized that, due to their high amino acid conservation, UBE2A and its paralog UBE2B might form heterodimers in vivo, as a mutual regulating mechanism. Under this hypothesis, the degradation of the mutated protein could be UBE2B dependent. The reduced autoubiquitination capacity of the mutated isoform could impair its degradation, and require the participation or the paralog. This would explain why the mutated protein was stable in the 916;rad6 yeast strain, but not in the patient´s cells with a functional UBE2B. Following the same reasoning, in wild type yeast, the presence of RAD6 would explain the absence of the mutated protein and toxicity. The non-viability of the double (UBE2A and UBE2B) knockout cells prevented testing whether the mutated protein was stable in the absence of its paralog. However, proteasome inhibition in cultured cells from one of our patients resulted in accumulation of the mutated protein, confirming its degradion via the ubiquitin-proteasome pathway. In conclusion, the UBE2A c.382C8594;T mutation seems to lead to mental retardation in our patients due to loss of UBE2A function: the mutated isoform is unable to rescue the UV-sensitivity phenotype of 916;rad6 yeast or to ubiquitinate histones in vitro. In addition, patients carrying UBE2A deletions share clinical manifestations with our patients. On the other hand, the possibility remains of a clinical effect of the requirement of UBE2B for degrading the mutated UBE2A. Our data suggest reciprocal ubiquitination in addition to autoubiquitination as UBE2A and UBE2B regulatory mechanism that would explain the conservation of the two paralog genes in mammals.
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Estudo da expressão de Arkadia, proteína E3 de ubiquitinação, em tumores de tiróide e sua relação com a via de sinalização de TGF-Beta. / Study of Arkadia expression, ubiquitination E-3 protein, in thyroid tumors and its relation to the TGF-beta signaling pathway.Rezende, Eloiza de 12 May 2009 (has links)
Arkadia participa do processo de amplificação da sinalização de TGF-b mediada por Smads, via degradação do I-Smad. O objetivo desse estudo foi caracterizar e investigar a influência de Arkadia em linhagens celulares de cânceres de tiróide. A expressão gênica de Arkadia em linhagens celulares de carcinomas papílifero (NPA), folicular (WRO) e anaplásico (ARO), foi avaliada por PCR quantitativo. Em ARO, que apresenta a maior expressão de Arkadia, foram identificados subclones (ARO_1 e ARO_2) com expressão diferencial de Arkadia, ARO_2>ARO_1. A expressão gênica de SMAD2, 3, 4, 7 e de genes do ciclo celular modulados por TGF-b, foi maior em ARO_2. Os subclones respondem ao tratamento com peptídeo de TGF-b1 e activina A. O crescimento in vivo (xenotransplante) mostra que ARO_2 desenvolve um tumor de menor volume. Recentemente a origem de ARO foi questionada e comprovamos sua origem por análises de expressão gênica e morfologias. Desta maneira, observamos que a expressão diferencial de Arkadia indica que ela está envolvida na modulação inibitória da via de TGF-b. / Arkadia is involved in the process of amplification of the TGF-b signaling mediated by Smads, by degradation of I-Smad. The aim of this study was to characterize and investigate the influence of Arkadia in thyroid cancers cell lines. Arkadia gene expression in the papillary (NPA), follicular (WRO) and anaplastic carcinoma cell lines (ARO) was evaluated by quantitative PCR. In ARO, which presents the highest Arkadia expression, we identified subclones (ARO_1 and ARO_2) with differential Arkadia expression ARO_2> ARO_1. The expression of SMAD2, 3, 4, 7 and the cell cycle genes modulated by TGF-b, was also higher in ARO_2. However both the subclones responded to treatment with peptide of TGF-b1 and activin A. The in vivo growth (evaluated by xenotransplant), showed that ARO_2 developed tumors of lower volume. Recently the ARO origin was questioned and we proved its origin by gene expression and morphological analysis. This way, the differential Arkadia expression indicates that it is involved in modulation of the inhibitory TGF-b pathway.
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O gene UBE2A (Ubiquitin conjugating enzyme 2 A) e a deficiência mental: triagem de mutações e estudos funcionais / UBE2A (Ubiquitin conjugating enzyme 2 A) gene and mental retardation: search for mutations and functional studiesRafaella Maria Pessutti Nascimento 06 August 2010 (has links)
Em trabalho anterior, identificamos a mutação c.382C8594;T no gene UBE2A, localizado em Xq24 e codificador de enzima conjugadora de ubiquitina, como causa de nova síndrome de deficiência mental (DM) de herança ligada ao cromossomo X. Foi a primeira descrição de mutação nesse gene e a primeira associação de mutação em gene que codifica conjugase de ubiquitina com patologia humana. Neste trabalho, focalizamos o gene UBE2A quanto a expressão dos transcritos alternativos, função das isoformas por eles codificadas e o efeito da mutação c.382C 8594; T como causa de deficiência mental (DM). No Capítulo I, revisamos os aspectos genéticos da DM, dando ênfase à herança ligada ao cromossomo X, principal causa de DM herdada e resumimos o estudo que levou à identificação da mutação em UBE2A como causa de quadro sindrômico de DM. Revisamos o papel da via de ubiquitinação de proteínas e das enzimas que participam do processo, em especial as conjugases de ubiquitina. Levantamos evidências na literatura que não deixam dúvida sobre a importância da via de ubiquitinação no sistema nervoso, tanto em processos de neurodesenvolvimento como neurodegeneração. No Capítulo II, avaliamos a contribuição de mutações em UBE2A como causa de DM. Apresentamos os resultados do sequenciamento direto da região codificadora do gene UBE2A em afetados de 23 famílias em que a DM segrega ligada à segmento que inclui Xq24, onde está localizado o gene UBE2A. Uma dessas famílias foi averiguada no Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociência, USP (LGH-IB/USP), coordenado pelo Dr. Paulo A. Otto e pela Dra. Angela Vianna Morgante. As demais 22 famílias pertencem ao banco de amostras do Consórcio Europeu de Deficiência Mental (European Mental Retardation Consortium EURO-MRX). A triagem foi também realizada em um indivíduo afetado por DM sindrômica que compartilha características clínicas com nossos pacientes. Como acontece com a maioria dos genes do cromossomo X, o gene UBE2A não parece ser responsável por parcela significativa dos casos de DM, já que novas mutações em UBE2A não foram detectadas nessa triagem. Avaliamos o efeito da mutação c.382C 8594; T nos níveis da transcrição e da tradução em homem afetado e em mulher portadora. A presença da mutação que leva a um códon de parada prematura não resultou na degradação do RNA, que detectamos nas células do afetado. Já na mulher portadora, apenas o transcrito normal foi detectado, de acordo com nossos dados anteriores que mostraram desvio completo no padrão de inativação do cromossomo X nas portadoras da mutação, tendo um mesmo cromossomo X ativo nas células do sangue. A vantagem proliferativa das células em que o cromossomo X com alelo mutado estava inativo deve ter levado a esse padrão de inativação desviado do casual, evidenciando o efeito deletério da mutação. Entretanto, o mecanismo pelo qual a mutação afeta a via de UBE2A permanece interrogado. A proteína UBE2A alterada foi encontrada em baixa quantidade nas células do paciente, o que pode ser o resultado de síntese prejudicada ou de degradação pós-traducão. Independente do mecanismo responsável, o fato de apenas uma pequena quantidade da proteína mutada ter sido encontrada, nos permite afirmar que, nas células desses indivíduos, há perda de função de UBE2A. Devemos, contudo, considerar que a proteína mutada é sintetizada e que, no caso de a menor quantidade dever-se à degradação pós-tradução, esse processo pode prejudicar a homeostase celular e contribuir para o quadro clínico. O capítulo II focaliza os transcritos alternativos de UBE2A. Diversos bancos de dados apontam para a existência de três transcritos alternativos do gene UBE2A humano, mas não há trabalho científico que caracterize os tecidos em que os transcritos são expressos ou a função das proteínas por eles codificadas. A mutação c.382C 8594; T localiza-se no éxon 6 do gene, comum a todos os transcritos, de forma que, no caso de eles codificarem proteínas funcionais, a mutação comprometeria três proteínas, e não apenas uma. Demonstramos que os três transcritos de UBE2A são xpressos em leucócitos, pré-adipócitos, placenta, córtex cerebral e hipocampo humanos. Detectamos também os três transcritos nas células de sangue e pré-adipócitos de um de nossos pacientes portador da mutação c.382C 8594; T. Embora os bancos de dados apontem para a existência de apenas um transcrito de UBE2A em camundongos, identificamos um transcrito alternativo correspondente ao transcrito alternativo 3 humano. Este foi detectado inclusive em camundongos nocaute quanto ao gene UBE2A o processo de geração do animal nocaute foi realizado por recombinação homóloga em que o cassete de neomicina foi inserido no éxon 1 do gene, de maneira que não eliminou a existência do transcrito correspondente ao transcrito 3 humano, que utiliza uma 5 UTR alternativa localizada no íntron 3. Entretanto, as proteínas codificadas pelos transcritos alternativos não foram detectadas nos extratos protéicos analisados humanos e de camundongo. Esse resultado poderia ser explicado pela falta de especificidade do anticorpo utilizado ou por essas isoformas representarem pequena parcela do pool de proteínas da célula. Os anticorpos comerciais anti-RAD6 e anti-HR6A/HR6B foram produzidos após imunização de coelhos com a porção N-terminal da isoforma 1. Seria, portanto, possível que não fossem capazes de detectar as isoformas 2 e 3, em que o segmento utilizado para a produção dos anticorpos está total ou parcialmente ausente. No caso de as proteínas estarem pouco representadas na célula, experimentos de co-imunoprecipitação auxiliariam na identificação dessas isoformas nos extratos protéicos. Entretanto, para a detecção de todas as isoformas de UBE2A seria necessário anticorpo que reconhecesse a porção C-terminal de UBE2A. Em 2009, duas novas mutações em UBE2A foram descritas em estudo colaborativo realizado no Welcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, Reino Unido, após sequenciamento em larga escala de aproximadamente 700 genes do cromossomo X de cerca de 200 indivíduos com DM de herança ligada ao X. Ambas as mutações c.215C 8594; T e c.328C 8594; G eram do tipo missense. Não foram fornecidas informações quanto ao quadro clínico dos portadores dessas mutações e também não foi esclarecido porque apenas a alteração c.215C 8594; T que resulta na troca do resíduo de fenilalanina da posição 72 por um resíduo de serina (F72S) foi considerada pelos autores como possivelmente patogênica. Nossos estudos in vitro, apresentados no Capítulo III, sugerem que ambas as alterações afetam a função de UBE2A. Em 2010, foram publicados dois trabalhos associando novas alterações em UBE2A a quadro de DM. Honda e col. (2010) descreveram uma microdeleção em Xq24 que inclui UBE2A e outros oito genes, em um menino com DM e características também presentes em nossos pacientes. Budny e col. (2010) descreveram mutações missense em UBE2A em duas famílias em que segregava quadro de DM sindrômica semelhante ao de nossos pacientes. Por comunicação pessoal de Arjan de Brouwer (Departamento de Genética Humana da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda), soubemos da existência de três outras microdeleções de segmentos do cromossomo X que incluem UBE2A, em pacientes do sexo masculino, não aparentados. Comparamos as características clínicas de nossos pacientes com as dos portadores das microdeleções em Xq24 e com aquelas dos portadores de mutações missense em UBE2A. A DM grave e o comprometimento significativo ou ausência de fala são comuns a todos. Outras características como baixa estatura, sinófris, boca grande e lábios finos com comissuras voltadas para baixo, pescoço curto e largo, implantação baixa de cabelos na nuca, mamilos espaçados, pênis pequeno, hirsutismo generalizado e a ocorrência de convulsões parecem predominar. Entretanto, enquanto a microcefalia aparece em dois dos três portadores de microdeleções avaliados, a macrocefalia parece predominar no grupo em que ocorrem as mutações de ponto. No Capítulo III, abordamos estudos funcionais in vivo e in vitro para avaliar se as isoformas alternativas de UBE2A compartilham suas funções de conjugase de ubiquitina e compreender o efeito da mutação c.382C8594;T na função de UBE2A. Buscamos estabelecer modelo celular para avaliar o efeito da mutação na formação de neuritos. Trabalho previamente publicado havia demonstrado que a diferenciação neuronal de células PC12 concomitantemente com a inibição parcial do mRNA de UBE2B (parálogo de UBE2A) resultava na redução de 20-30% do comprimento de neuritos. Entretanto, nossos ensaios de diferenciação de pré-adipócitos não responderam nossas questões sobre o efeito da mutação na formação de neuritos, pois não conseguimos obter, nas células do controle ou nas do paciente, a densidade de neuritos descrita anteriormente na diferenciação de pré-adipócitos. Diferentemente das células PC12, de origem ectodérmica, os pré-adipócitos tem origem mesodérmica, o que dificulta sua diferenciação em linhagem derivada de outro folheto germinativo. A elevada conservação entre as proteínas ortólogas UBE2A e UBE2B humanas e RAD6 de levedura e a observação de que ambas as parálogas humanas são capazes de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de Saccharomyces cerevisiae nos levou a considerar a linhagem de levedura 916;rad6 como modelo para nossos estudos funcionais. Também, avaliamos a capacidade das isoformas 2 e 3 e da isoforma Q128X de UBE2A para ubiquitinar histonas H2A in vitro, conforme previamente descrito para a isoforma UBE2A/1. Os resultados dos ensaios in vivo indicam que apenas a expressão do transcito 1 de UBE2A é capaz de complementar os fenótipos apresentados pela linhagem 916;rad6 de S. cerevisiae. A expressão dos transcritos 2 ou 3 não resulta na restituição do fenótipo de sensibilidade à UV - a expressão gera certa toxicidade, agravada quando as células são cultivadas a 37o C. Entretanto, as isoformas por eles codificadas não parecem ser estáveis na levedura: assim como nos tecidos humanos testados, não conseguimos detectá-las nos extratos protéicos das leveduras que expressavam esses transcritos. A expressão do transcrito 1 contendo a mutação c.382CT revelou que a isoforma UBE2A/Q128X, por sua vez, é estável na linhagem 916;rad6, porém, além de não restituir o fenótipo de sensibilidade à UV, foi, dentre as isoformas de UBE2A, a mais tóxica. Os fenótipos de toxicidade não foram observados após expressão em linhagem selvagem de S. cerevisiae. Esses resultados indicam que as isoformas 2 e 3 de UBE2A não apresentam atividade de conjugase de ubiquitina e que são, aparentemente, degradadas imediatamente após sua expressão em levedura. O fato de o fenótipo de toxicidade ser agravado, em condições de choque térmico, apóia a hipótese de degradação dessas isoformas, em levedura. A degradação pode ser resultado da ausência de parceiro que permita sua estabilidade, mas a ausência das isoformas também em extratos protéicos de tecidos humanos sugere que o mesmo processo de degradação ocorra em mamíferos. Segundo a classificação das E2, as diversas conjugases de ubiquitina têm em comum o domínio UBC altamente conservado e as variações observadas consistem em inserções ou extensões C-terminais, mas nunca deleções, como ocorre nas isoformas 2 e 3 de UBE2A. Os transcritos alternativos teriam, assim, função regulatória. Os ensaios in vitro confirmaram a capacidade de UBE2A/1 ubiquitinar histonas H2A. Os ensaios com UBE2A/2 e UBE2A/3 não foram conclusivos, uma vez que a incapacidade de ubiquitinação de histonas que observamos pode ter consequência da renaturação in vitro, que pode ter ocorrido prejudicando sua função. Entretanto a obtenção das isoformas puras nos permitiu verificar que, caso a isoforma 2 estivesse presente nos extratos de levedura, ela seria reconhecida pelo anticorpo anti-RAD6. Verificamos que a proteína mutada UBE2A/Q128X é capaz de interagir com a E1, da qual recebe a molécula de ubiquitina, mas não é capaz de transferi-la para a histona. O segmento C-terminal ausente nessa isoforma é, portanto, importante nesse processo. Os ensaios in vitro despertaram nossa atenção para o fenômeno de autoubiquitinação de UBE2A, possível mecanismo de autorregulação previamente considerado na literatura. O fato de alguns trabalhos sugerirem que as E2 atuem também como dímeros in vivo e in vitro e a elevada conservação entre as parálogas humanas UBE2A e UBE2B nos levaram a considerar a possibilidade de mecanismo de regulação recíproca. Dessa maneira, a degradação de UBE2A/Q128X nas células do paciente poderia ser dependente de UBE2B. A reduzida capacidade de autoubiquitinação da isoforma mutada dificultaria sua degradação e tornaria necessária a atividade da paráloga. Isso explicaria porque ela é estável quando expressa na linhagem de levedura 916;rad6, mas não nas células do paciente. A presença de RAD6 estaria diretamente relacionada à ausência de toxicidade após a expressão de UBE2A/Q128X em linhagem selvagem a degradação da isoforma mutada está ocorrendo nessas células. A não viabilidade de camundongo duplo-nocaute quanto as parálogas UBE2A e UBE2B não permite testar a estabilidade da isoforma mutada em células de mamíferos. Observamos, de fato, que a inibição do proteassoma nas células do paciente leva ao acúmulo dessa proteína. A presença da mutação c.382C8594;T nas células do paciente parece resultar no fenótipo de DM devido à perda de função de UBE2A: a isoforma mutada não restitui o fenótipo de sensibilidade à UV de S. cerevisiae e não foi capaz de ubiquitinar histonas H2A in vitro. Além disso, indivíduos com microdeleções de UBE2A apresentam fenótipo semelhante ao de nossos pacientes. Por outro lado, a presença da proteína mutada que necessitaria de UBE2B para ser degradada pode caracterizar um ganho tóxico de função - comprometeria a função de ambas as parálogas. É possível que os dois mecanismos contribuam para o quadro clínico. Os dados dos ensaios in vivo e in vitro abrem caminhos de investigação do processo de regulação de UBE2A e UBE2B no nível da proteína, sugerindo a autoubiquitinação e a ubiquitinaão recíproca como possíveis mecanismos reguladores, que podem explicar a conservação das duas parálogas de RAD6 em mamíferos. / We have previously described a nonsense mutation (c.382C8594;T) in the UBE2A gene, at Xq24, which encodes a ubiquitin conjugating enzyme (E2), as the cause of a new X-linked mental retardation syndrome. The predicted protein lacks the 25 C-terminal amino acid residues conserved in vertebrates and in Drosophila. This was the first description of a mutation in a ubiquitin conjugating enzyme gene causative of a human disease. In the present work, we focused on the UBE2A gene, its alternative transcripts and isoforms, and the effect of the c.382C8594;T mutation. We screened for UBE2A mutations 23 males presenting X-linked mental retardation (XLMR), previously mapped to the interval encompassing this gene, and one isolated case, who shared clinical features with our previously described patients. No mutations were detected in this selected series of patients suggesting that mutations in UBE2A is not a common cause of XLMR, similarly to the majority of the XLMR genes hereto described. Very recently four Xq24 microdeletions encompassing UBE2A and three missence mutations were found by other groups in mentally retarded males that shared several clinical features with our patients. Comparing these and our patients, a clinical picture emerges of mental retardation associated with severe speech impairment, present in all of them. Short stature, large mouth with downturned corners and thin lips, short and broad neck, low posterior hairline, widely spaced nipples, marked generalized hirsutism and seizures are common features. However, microcephaly was observed only in patients carrying UBE2A deletions, while carriers of missense or nonsense mutations showed macrocephaly. We evaluated the effect of the UBE2A c.382C8594;T mutation on transcription and translation. This mutation affects the last UBE2A exon and, as expected, does not lead to nonsense mediated RNA decay, demonstrated by the presence of UBE2A mRNA in leucocytes of an affected male. However, only a small amount of the mutated protein was detected in the patients cells, suggesting the loss of UBE2A function as the cause of the syndrome. The posttranslational degradation of the mutated protein could also disturb the cellular homeostasis, a gain of function that remained a possibility. The detrimental effect of the c.382C8594;T mutation was further supported by the presence of only the normal transcript in leucocytes of a heterozygous woman, who had completely skewed X inactivation, thus pointing to the selective advantage of lymphocytes carrying the normal allele on the active X chromosome. Our search in DNA and protein sequence databases suggested that the UBE2A gene produces three alternative transcripts all classified as protein coding. These three tanscripts contain the mutation site (c.382C8594;T). We showed that all three UBE2A transcripts are expressed in human leucocytes, adipocytes, placenta, cerebral cortex and hippocampus. We also detected an alternative transcript in murine, which corresponds to the human transcript 3. This alternative transcript was present in all murine tissues analyzed, including samples from a UBE2A knockout mouse. However, we failed to detect the proteins encoded by the alternative transcripts. This could result from low affinity of the used commercial antibody to the isoforms. Alternatively, a small amount of these proteins in the pool of cellular proteins, might have not been detected by Western blotting. We performed in vivo and in vitro assays to address the role of the alternative UBE2A isoforms, and to evaluate the effect of c.382C-T mutation on UBE2A function. Taking into account the high amino acid conservation between the human UBE2A and the Saccharomyces cerevisiae ortholog RAD6, we used a 916;rad6 yeast strain to verify whether UBE2A alternative and mutated isoforms were able to complement its UV-sensitivity phenotype, as previously demosntrated for UBE2A isoform 1. We also performed in vitro assays to evaluate their ubiquitination activity towards histone H2A, a known in vitro substrate of RAD6 and UBE2A. Only UBE2A isoform 1 could rescue the UV sensitivity phenotype of the knockout yeast strain. The expression of the alternative isoforms 2 and 3 was partially toxic to this yeast strain, and toxicity increased under heat shock conditions. However, these two isoforms do not seem to be stable in yeast cells: as in human tissues, we failed to detect UBE2A isoforms 2 and 3 in yeast cells expressing the corresponding transcripts. The mutant isoform was stable in yeast, but was unable to rescue the UV-sensitivity phenotype, its expression resulting in severe toxicity to the 916;rad6 strain. On the other hand, toxicity was not observed when the mutant UBE2A isoform was expressed in wild type yeast. These findings suggest that isoforms 2 and 3 do not have ubiquitin conjugating activity and, apparently, are degraded immediately after translation. The fact that toxicity is enhanced when these isoforms are expressed under heat shock conditions supports Degradation hypothesis. The degradation could also be due to the absence of a functional partner, in yeast, that could contribute to their stability. Since the alternative isoforms were not detected in the human tissues analyzed, the degradation might occur in human cells as well. E2 enzymes share a catalytic domain and variations among them consist of insertions or terminal extensions, never deletions. Both isoforms 2 and 3 would have deletions of the catalytic domain, suggesting that they are not functional. A regulatory role for these transcripts is a possibility. Our in vitro assays confirmed that UBE2A isoform 1 is capable of histone H2A ubiquitination. The assays for isoforms 2 and 3 were inconclusive, since their lack of ubiquitin conjugating activity could be caused by incorrect in vitro refolding, required because the proteins were obtained from bacterial inclusion bodies after heterologous expression. The mutated protein, however, was able to interact with the ubiquitin molecule, but failed to transfer it to histones, thus pointing to the importance of the C-terminal segment in this process. Our in vitro assays stongly suggested that UBE2A autoubiquitination occur, an activity previously considered a possible E2 regulatory mechanism. Since there is evidence that some E2s form functional dimers, we hypothesized that, due to their high amino acid conservation, UBE2A and its paralog UBE2B might form heterodimers in vivo, as a mutual regulating mechanism. Under this hypothesis, the degradation of the mutated protein could be UBE2B dependent. The reduced autoubiquitination capacity of the mutated isoform could impair its degradation, and require the participation or the paralog. This would explain why the mutated protein was stable in the 916;rad6 yeast strain, but not in the patient´s cells with a functional UBE2B. Following the same reasoning, in wild type yeast, the presence of RAD6 would explain the absence of the mutated protein and toxicity. The non-viability of the double (UBE2A and UBE2B) knockout cells prevented testing whether the mutated protein was stable in the absence of its paralog. However, proteasome inhibition in cultured cells from one of our patients resulted in accumulation of the mutated protein, confirming its degradion via the ubiquitin-proteasome pathway. In conclusion, the UBE2A c.382C8594;T mutation seems to lead to mental retardation in our patients due to loss of UBE2A function: the mutated isoform is unable to rescue the UV-sensitivity phenotype of 916;rad6 yeast or to ubiquitinate histones in vitro. In addition, patients carrying UBE2A deletions share clinical manifestations with our patients. On the other hand, the possibility remains of a clinical effect of the requirement of UBE2B for degrading the mutated UBE2A. Our data suggest reciprocal ubiquitination in addition to autoubiquitination as UBE2A and UBE2B regulatory mechanism that would explain the conservation of the two paralog genes in mammals.
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Estudo da expressão de Arkadia, proteína E3 de ubiquitinação, em tumores de tiróide e sua relação com a via de sinalização de TGF-Beta. / Study of Arkadia expression, ubiquitination E-3 protein, in thyroid tumors and its relation to the TGF-beta signaling pathway.Eloiza de Rezende 12 May 2009 (has links)
Arkadia participa do processo de amplificação da sinalização de TGF-b mediada por Smads, via degradação do I-Smad. O objetivo desse estudo foi caracterizar e investigar a influência de Arkadia em linhagens celulares de cânceres de tiróide. A expressão gênica de Arkadia em linhagens celulares de carcinomas papílifero (NPA), folicular (WRO) e anaplásico (ARO), foi avaliada por PCR quantitativo. Em ARO, que apresenta a maior expressão de Arkadia, foram identificados subclones (ARO_1 e ARO_2) com expressão diferencial de Arkadia, ARO_2>ARO_1. A expressão gênica de SMAD2, 3, 4, 7 e de genes do ciclo celular modulados por TGF-b, foi maior em ARO_2. Os subclones respondem ao tratamento com peptídeo de TGF-b1 e activina A. O crescimento in vivo (xenotransplante) mostra que ARO_2 desenvolve um tumor de menor volume. Recentemente a origem de ARO foi questionada e comprovamos sua origem por análises de expressão gênica e morfologias. Desta maneira, observamos que a expressão diferencial de Arkadia indica que ela está envolvida na modulação inibitória da via de TGF-b. / Arkadia is involved in the process of amplification of the TGF-b signaling mediated by Smads, by degradation of I-Smad. The aim of this study was to characterize and investigate the influence of Arkadia in thyroid cancers cell lines. Arkadia gene expression in the papillary (NPA), follicular (WRO) and anaplastic carcinoma cell lines (ARO) was evaluated by quantitative PCR. In ARO, which presents the highest Arkadia expression, we identified subclones (ARO_1 and ARO_2) with differential Arkadia expression ARO_2> ARO_1. The expression of SMAD2, 3, 4, 7 and the cell cycle genes modulated by TGF-b, was also higher in ARO_2. However both the subclones responded to treatment with peptide of TGF-b1 and activin A. The in vivo growth (evaluated by xenotransplant), showed that ARO_2 developed tumors of lower volume. Recently the ARO origin was questioned and we proved its origin by gene expression and morphological analysis. This way, the differential Arkadia expression indicates that it is involved in modulation of the inhibitory TGF-b pathway.
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Caracterização de um Novo Gene da Família F-box Expresso no Pistilo de Nicotiana tabacum L. / Characterization of a New F-box Family Gene Expressed in the Nicotiana tabacum L. PistilSamantha Vieira Abbad 13 August 2012 (has links)
O estudo da reprodução sexual de plantas e uma área de crescente interesse devido a importância de sementes e frutos em nossa dieta diária, ambos resultantes do desenvolvimento de partes do pistilo, apos fertilização. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um novo gene F-box expresso no pistilo de N. tabacum. Proteínas F-box atuam na interação proteína-proteína, geralmente direcionando proteínas alvo para degradação pela via ubiquitina-proteassomo. Foram identificados cinco genes de função desconhecida que codificam putativas proteínas F-box, em duas bibliotecas de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009) previamente construídas em nosso laboratório. A expressão de cada um destes genes foi analisada nos diferentes órgãos de N. tabacum, por qRT-PCR. O clone 085H05 da biblioteca TOBEST (QUIAPIM et al., 2009) apresentou expressão preferencial nos órgãos florais. Este clone foi selecionado para uma caracterização funcional mais detalhada. O padrão de expressão deste gene foi avaliado no estigma/estilete durante os 12 estádios do desenvolvimento floral de N. tabacum (KOLTUNOW et al., 1990). O resultado revelou que sua expressão e regulada durante o desenvolvimento, atingindo o maior nível de expressão na antese (estádio 12). Isto sugere que este gene esteja envolvido no desenvolvimento do estigma/estilete. A sequência codificadora do gene correspondente a 085H05 foi determinada e, apos amplificação e clonagem, este gene foi denominado S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). Para compreender a função da proteína de S/S_F-box, plantas transgênicas de superexpressao e de silenciamento (por RNAi) deste gene foram geradas. As plantas de RNAi apresentaram o estilete e o ovário reduzidos quando comparados ao controle SR1. Em concordância, as plantas de superexpressao produziram flores com o estilete mais alongado do que o controle, alem do estigma e do ovário de maior tamanho. Altas concentrações de exudato foram observadas na superfície do estigma destas plantas, a partir do estádio 7 tardio. No controle SR1, concentrações equivalentes apenas são observadas nos estádios finais do desenvolvimento. Os fenótipos observados nas plantas transgênicas sugerem que a proteína codificada por S/S_F-box esteja envolvida com o desenvolvimento do pistilo e com o controle do tamanho deste órgão. Adicionalmente, as plantas de RNAi apresentaram o fenótipo de perda da dominância apical. Os níveis de expressão do gene S/S_F-box foram avaliados em plantas que tiveram aumento na produção de auxina no estigma/estilete (plantas STIG1prom::iaaM), revelando que este gene não e regulado, a nível transcricional, por este hormônio. Experimentos de localização subcelular, realizados por expressão transitória da sequência de S/S_F-box fusionada a sequência dos genes repórteres GFP e YFP (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), indicaram que a proteína S/S_F-box esta localizada no citoplasma e no núcleo celular. Adicionalmente, foi realizado o screening de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete, construída no sistema de duplo-hibrido, para investigar proteínas candidatas a interagirem com a proteína de S/S_F-box. Os resultados indicaram interação da proteína S/S_F-box com SKP1, confirmando a participação de S/S_F-box no complexo SCF, que promove a degradação de proteínas alvo pela via ubiquitina-proteassomo. Duas proteínas candidatas a alvo foram identificadas: os fatores de transcrição VOZ1 e SIP1, ambos envolvidos com a proliferação celular. Em suma, e possível propor que a proteína codificada por S/S_F-box tenha função relacionada a proliferação celular e ao desenvolvimento dos órgãos vegetais, incluindo o pistilo. / The study of sexual reproduction in plants is an area of increasing interest due to the importance of seeds and fruits in our daily diet, both resulting from the development of parts of the pistil, after fertilization. The aim of this study was to characterize a new F-box gene expressed in the N. tabacum pistil. F-box proteins act in protein-protein interactions, generally directing target proteins to degradation via ubiquitin-proteasome. Five genes of unknown function coding for putative F-box proteins were identified at two cDNAs libraries from N. tabacum stigmas/styles (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009), previously constructed in our laboratory. The expression of each of these genes was analyzed in the different N. tabacum organs, by qRT-PCR. The 085H05 clone from the TOBEST library (QUIAPIM et al., 2009) showed preferential expression in floral organs. This clone was select for a more detailed functional characterization. The expression pattern of this gene was evaluated in the stigma/style during the 12 N. tabacum flower developmental stages (KOLTUNOW et al., 1990). The result revealed that its expression is regulated during development, reaching the highest expression level at anthesis (stage 12). It suggests that this gene is involved in the stigma/style development. The coding sequence of the gene corresponding to 085H05 was determined and, after amplification and cloning, the gene was named S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). To understand the S/S_F-box protein function, transgenic plants either overexpressing or silencing (by RNAi) the S/S_F-box gene were generated. The RNAi plants showed reduced style and ovary when compared to the control SR1. In accordance, the overexpressing plants produced flowers with a style more elongated than the control, besides an ovary and a stigma of larger size. High concentrations of exudate were observed on the stigma surface of these plants, since the later stage 7. In the control SR1, equivalent concentrations are only observed at the later stages of development. The phenotypes observed in the transgenic plants suggest that the protein encoded by S/S_F-box is involved with pistil development and with the control of pistil size. Additionally, the RNAi plants showed the phenotype of loss of apical dominance. The expression levels of the S/S_F-box gene were evaluated in plants with increased auxin production in the stigma/style (plants STIG1prom::iaaM), showing that this gene is not transcriptionally regulated by this hormone. Subcellular localization experiments, carried out by transient expression of the S/S_F-box sequence fused to the reporter genes GFP and YFP V (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), showed that the S/S_F-box protein is localized in the cytoplasm and in the nucleus. Additionally, the screening of a stigma/style cDNA library constructed on the yeast two hybrid system was performed, to investigate candidate proteins for S/S_F-box protein interaction. The results indicated interaction between S/S_Fbox and the SKP1 protein, confirming the involvement of the S/S_F-box protein in the SCF complex, which promotes degradation of target proteins via ubiquitin-proteasome. Two candidates for target proteins were identified: the transcription factors VOZ1 and SIP1, both involved in cell proliferation. In summary, it is possible to propose that the protein encoded by S/S_F-box has functions related to cell proliferation and organ development, including the pistil.
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Caracterização de um Novo Gene da Família F-box Expresso no Pistilo de Nicotiana tabacum L. / Characterization of a New F-box Family Gene Expressed in the Nicotiana tabacum L. PistilAbbad, Samantha Vieira 13 August 2012 (has links)
O estudo da reprodução sexual de plantas e uma área de crescente interesse devido a importância de sementes e frutos em nossa dieta diária, ambos resultantes do desenvolvimento de partes do pistilo, apos fertilização. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um novo gene F-box expresso no pistilo de N. tabacum. Proteínas F-box atuam na interação proteína-proteína, geralmente direcionando proteínas alvo para degradação pela via ubiquitina-proteassomo. Foram identificados cinco genes de função desconhecida que codificam putativas proteínas F-box, em duas bibliotecas de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009) previamente construídas em nosso laboratório. A expressão de cada um destes genes foi analisada nos diferentes órgãos de N. tabacum, por qRT-PCR. O clone 085H05 da biblioteca TOBEST (QUIAPIM et al., 2009) apresentou expressão preferencial nos órgãos florais. Este clone foi selecionado para uma caracterização funcional mais detalhada. O padrão de expressão deste gene foi avaliado no estigma/estilete durante os 12 estádios do desenvolvimento floral de N. tabacum (KOLTUNOW et al., 1990). O resultado revelou que sua expressão e regulada durante o desenvolvimento, atingindo o maior nível de expressão na antese (estádio 12). Isto sugere que este gene esteja envolvido no desenvolvimento do estigma/estilete. A sequência codificadora do gene correspondente a 085H05 foi determinada e, apos amplificação e clonagem, este gene foi denominado S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). Para compreender a função da proteína de S/S_F-box, plantas transgênicas de superexpressao e de silenciamento (por RNAi) deste gene foram geradas. As plantas de RNAi apresentaram o estilete e o ovário reduzidos quando comparados ao controle SR1. Em concordância, as plantas de superexpressao produziram flores com o estilete mais alongado do que o controle, alem do estigma e do ovário de maior tamanho. Altas concentrações de exudato foram observadas na superfície do estigma destas plantas, a partir do estádio 7 tardio. No controle SR1, concentrações equivalentes apenas são observadas nos estádios finais do desenvolvimento. Os fenótipos observados nas plantas transgênicas sugerem que a proteína codificada por S/S_F-box esteja envolvida com o desenvolvimento do pistilo e com o controle do tamanho deste órgão. Adicionalmente, as plantas de RNAi apresentaram o fenótipo de perda da dominância apical. Os níveis de expressão do gene S/S_F-box foram avaliados em plantas que tiveram aumento na produção de auxina no estigma/estilete (plantas STIG1prom::iaaM), revelando que este gene não e regulado, a nível transcricional, por este hormônio. Experimentos de localização subcelular, realizados por expressão transitória da sequência de S/S_F-box fusionada a sequência dos genes repórteres GFP e YFP (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), indicaram que a proteína S/S_F-box esta localizada no citoplasma e no núcleo celular. Adicionalmente, foi realizado o screening de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete, construída no sistema de duplo-hibrido, para investigar proteínas candidatas a interagirem com a proteína de S/S_F-box. Os resultados indicaram interação da proteína S/S_F-box com SKP1, confirmando a participação de S/S_F-box no complexo SCF, que promove a degradação de proteínas alvo pela via ubiquitina-proteassomo. Duas proteínas candidatas a alvo foram identificadas: os fatores de transcrição VOZ1 e SIP1, ambos envolvidos com a proliferação celular. Em suma, e possível propor que a proteína codificada por S/S_F-box tenha função relacionada a proliferação celular e ao desenvolvimento dos órgãos vegetais, incluindo o pistilo. / The study of sexual reproduction in plants is an area of increasing interest due to the importance of seeds and fruits in our daily diet, both resulting from the development of parts of the pistil, after fertilization. The aim of this study was to characterize a new F-box gene expressed in the N. tabacum pistil. F-box proteins act in protein-protein interactions, generally directing target proteins to degradation via ubiquitin-proteasome. Five genes of unknown function coding for putative F-box proteins were identified at two cDNAs libraries from N. tabacum stigmas/styles (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009), previously constructed in our laboratory. The expression of each of these genes was analyzed in the different N. tabacum organs, by qRT-PCR. The 085H05 clone from the TOBEST library (QUIAPIM et al., 2009) showed preferential expression in floral organs. This clone was select for a more detailed functional characterization. The expression pattern of this gene was evaluated in the stigma/style during the 12 N. tabacum flower developmental stages (KOLTUNOW et al., 1990). The result revealed that its expression is regulated during development, reaching the highest expression level at anthesis (stage 12). It suggests that this gene is involved in the stigma/style development. The coding sequence of the gene corresponding to 085H05 was determined and, after amplification and cloning, the gene was named S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). To understand the S/S_F-box protein function, transgenic plants either overexpressing or silencing (by RNAi) the S/S_F-box gene were generated. The RNAi plants showed reduced style and ovary when compared to the control SR1. In accordance, the overexpressing plants produced flowers with a style more elongated than the control, besides an ovary and a stigma of larger size. High concentrations of exudate were observed on the stigma surface of these plants, since the later stage 7. In the control SR1, equivalent concentrations are only observed at the later stages of development. The phenotypes observed in the transgenic plants suggest that the protein encoded by S/S_F-box is involved with pistil development and with the control of pistil size. Additionally, the RNAi plants showed the phenotype of loss of apical dominance. The expression levels of the S/S_F-box gene were evaluated in plants with increased auxin production in the stigma/style (plants STIG1prom::iaaM), showing that this gene is not transcriptionally regulated by this hormone. Subcellular localization experiments, carried out by transient expression of the S/S_F-box sequence fused to the reporter genes GFP and YFP V (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), showed that the S/S_F-box protein is localized in the cytoplasm and in the nucleus. Additionally, the screening of a stigma/style cDNA library constructed on the yeast two hybrid system was performed, to investigate candidate proteins for S/S_F-box protein interaction. The results indicated interaction between S/S_Fbox and the SKP1 protein, confirming the involvement of the S/S_F-box protein in the SCF complex, which promotes degradation of target proteins via ubiquitin-proteasome. Two candidates for target proteins were identified: the transcription factors VOZ1 and SIP1, both involved in cell proliferation. In summary, it is possible to propose that the protein encoded by S/S_F-box has functions related to cell proliferation and organ development, including the pistil.
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