Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. / Made available in DSpace on 2012-10-17T23:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T16:57:19Z : No. of bitstreams: 1 170182.pdf: 5190064 bytes, checksum: b256fb8780554d500eeda908103aeaa6 (MD5)

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de níquel, que estão envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e em mecanismos de defesa em plantas. Nosso grupo descreveu a atividade inseticida da Canatoxina, uma isoforma da urease. Esta toxicidade envolve a liberação de um peptídeo interno de 10 kDa (pepcanatox) da proteína, por ação hidrólitica de catepsinas encontradas no sistema digestivo de insetos suscetíveis. Baseado na sequência N-terminal do pepcanatox, um fragmento de 270 pb correspondente (jaburetox-2Ec) foi clonado, a partir da sequência da JBURE-II, e expresso em Escherichia coli. Este peptídeo recombinante Jaburetox-2Ec (carregando epítopo V5 e cauda His) foi testado contra os insetos Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus e Spodoptera frugiperda e 100% de mortalidade foi observado em todos os modelos após a ingestão de microgramas do peptídeo. Outros dados mostram que jaburetox-2Ec tem capacidade de interagir com bicamadas lipídicas acídicas, permeabilizando lipossomas, além de atividade antifúngica. Estudos de modelagem do peptídeo revelaram a presença de um grampo beta, que poderia estar envolvido nesta toxicidade. A fim de estudar os motivos envolvidos nestas atividades biológicas, escolhemos uma abordagem de mutagênese dirigida. Para isto, a sequência de DNA do jaburetox foi clonado em plasmídeo pET-23a, obtendo-se a expressão do jaburetox, contendo apenas cauda de histidina, e a partir deste, obtivemos diferentes mutantes: 1) deleção de todo o grampo beta (aminoácidos 61-75); 2) deleção da metade N-terminal do peptídeo, que corresponde a uma região ausente nas ureases bacterianas; 3) deleção da metade C-terminal do peptídeo. Ensaios de formação de canais iônicos em bicamadas lipídicas artificiais com o jaburetox e mutantes mostraram que todos formam canais iônicos, ainda que com diferentes características. Bioensaios com o percevejo Oncopeltus fasciatus (injeção na hemocele) e leveduras mostraram que a região do grampo-beta não está envolvida nos efeitos do peptídeo nesses organismos, sendo que é a região Nterminal responsável pelas atividades inseticida e antifúngica do Jaburetox. / Urease (EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes, that are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms in plants. Our group described the insecticidal activity of canatoxin, an isoform of urease. This toxicity involves the release of an internal peptide of 10 kDa (pepcanatox), released by the hydrolytic action of cathepsins found in the susceptible insects gut. Based on the N-terminal sequence of pepcanatox, a corresponding fragment of 270 bp (jaburetox-2Ec) was cloned from the JBURE-II and expressed in Escherichia coli. This recombinant peptide Jaburetox-2Ec (carrying the V5 epitope and His tag) was tested against the insect Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus and Spodoptera frugiperda, and 100% mortality was observed in all the models after ingestion of micrograms of the peptide. Other data showed that Jaburetox-2Ec has the ability to interact with acidic lipid bilayers, liposomes leakage and also antifungal activity. Molecular modeling studies of the peptide revealed the presence of a β-hairpin motif, which could be involved in this toxicity. In order to identify structures involved in the biological activities, we chose a directed mutagenesis approach. For this, the jaburetox cDNA was cloned into pET-23a vector (to yield the expression of jaburetox containing only histidine tag), and from this, we obtained different mutants: 1) deletion of the entire β- hairpin motif (amino acids 61 -75); 2) deletion of the N-terminal half of the peptide, which corresponds to a region absent in bacterial ureases; 3) deletion of the C-terminal half of the peptide. Planar lipid bilayers experiments were performed with jaburetox and all mutants, and we observed channels activity in all cases. Bioassays with Oncopeltus fasciatus and Rhodnius prolixus showed that the region of β-hairpin is not involved in the effects of the peptide in these organisms, and the N-terminal region of the Jbtx carries the most important entomotoxic domain which is fully active in the absence of the β-hairpin motif.

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de níquel, que estão envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e em mecanismos de defesa em plantas. Nosso grupo descreveu a atividade inseticida da Canatoxina, uma isoforma da urease. Esta toxicidade envolve a liberação de um peptídeo interno de 10 kDa (pepcanatox) da proteína, por ação hidrólitica de catepsinas encontradas no sistema digestivo de insetos suscetíveis. Baseado na sequência N-terminal do pepcanatox, um fragmento de 270 pb correspondente (jaburetox-2Ec) foi clonado, a partir da sequência da JBURE-II, e expresso em Escherichia coli. Este peptídeo recombinante Jaburetox-2Ec (carregando epítopo V5 e cauda His) foi testado contra os insetos Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus e Spodoptera frugiperda e 100% de mortalidade foi observado em todos os modelos após a ingestão de microgramas do peptídeo. Outros dados mostram que jaburetox-2Ec tem capacidade de interagir com bicamadas lipídicas acídicas, permeabilizando lipossomas, além de atividade antifúngica. Estudos de modelagem do peptídeo revelaram a presença de um grampo beta, que poderia estar envolvido nesta toxicidade. A fim de estudar os motivos envolvidos nestas atividades biológicas, escolhemos uma abordagem de mutagênese dirigida. Para isto, a sequência de DNA do jaburetox foi clonado em plasmídeo pET-23a, obtendo-se a expressão do jaburetox, contendo apenas cauda de histidina, e a partir deste, obtivemos diferentes mutantes: 1) deleção de todo o grampo beta (aminoácidos 61-75); 2) deleção da metade N-terminal do peptídeo, que corresponde a uma região ausente nas ureases bacterianas; 3) deleção da metade C-terminal do peptídeo. Ensaios de formação de canais iônicos em bicamadas lipídicas artificiais com o jaburetox e mutantes mostraram que todos formam canais iônicos, ainda que com diferentes características. Bioensaios com o percevejo Oncopeltus fasciatus (injeção na hemocele) e leveduras mostraram que a região do grampo-beta não está envolvida nos efeitos do peptídeo nesses organismos, sendo que é a região Nterminal responsável pelas atividades inseticida e antifúngica do Jaburetox. / Urease (EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes, that are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms in plants. Our group described the insecticidal activity of canatoxin, an isoform of urease. This toxicity involves the release of an internal peptide of 10 kDa (pepcanatox), released by the hydrolytic action of cathepsins found in the susceptible insects gut. Based on the N-terminal sequence of pepcanatox, a corresponding fragment of 270 bp (jaburetox-2Ec) was cloned from the JBURE-II and expressed in Escherichia coli. This recombinant peptide Jaburetox-2Ec (carrying the V5 epitope and His tag) was tested against the insect Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus and Spodoptera frugiperda, and 100% mortality was observed in all the models after ingestion of micrograms of the peptide. Other data showed that Jaburetox-2Ec has the ability to interact with acidic lipid bilayers, liposomes leakage and also antifungal activity. Molecular modeling studies of the peptide revealed the presence of a β-hairpin motif, which could be involved in this toxicity. In order to identify structures involved in the biological activities, we chose a directed mutagenesis approach. For this, the jaburetox cDNA was cloned into pET-23a vector (to yield the expression of jaburetox containing only histidine tag), and from this, we obtained different mutants: 1) deletion of the entire β- hairpin motif (amino acids 61 -75); 2) deletion of the N-terminal half of the peptide, which corresponds to a region absent in bacterial ureases; 3) deletion of the C-terminal half of the peptide. Planar lipid bilayers experiments were performed with jaburetox and all mutants, and we observed channels activity in all cases. Bioassays with Oncopeltus fasciatus and Rhodnius prolixus showed that the region of β-hairpin is not involved in the effects of the peptide in these organisms, and the N-terminal region of the Jbtx carries the most important entomotoxic domain which is fully active in the absence of the β-hairpin motif.

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de níquel, que estão envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e em mecanismos de defesa em plantas. Nosso grupo descreveu a atividade inseticida da Canatoxina, uma isoforma da urease. Esta toxicidade envolve a liberação de um peptídeo interno de 10 kDa (pepcanatox) da proteína, por ação hidrólitica de catepsinas encontradas no sistema digestivo de insetos suscetíveis. Baseado na sequência N-terminal do pepcanatox, um fragmento de 270 pb correspondente (jaburetox-2Ec) foi clonado, a partir da sequência da JBURE-II, e expresso em Escherichia coli. Este peptídeo recombinante Jaburetox-2Ec (carregando epítopo V5 e cauda His) foi testado contra os insetos Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus e Spodoptera frugiperda e 100% de mortalidade foi observado em todos os modelos após a ingestão de microgramas do peptídeo. Outros dados mostram que jaburetox-2Ec tem capacidade de interagir com bicamadas lipídicas acídicas, permeabilizando lipossomas, além de atividade antifúngica. Estudos de modelagem do peptídeo revelaram a presença de um grampo beta, que poderia estar envolvido nesta toxicidade. A fim de estudar os motivos envolvidos nestas atividades biológicas, escolhemos uma abordagem de mutagênese dirigida. Para isto, a sequência de DNA do jaburetox foi clonado em plasmídeo pET-23a, obtendo-se a expressão do jaburetox, contendo apenas cauda de histidina, e a partir deste, obtivemos diferentes mutantes: 1) deleção de todo o grampo beta (aminoácidos 61-75); 2) deleção da metade N-terminal do peptídeo, que corresponde a uma região ausente nas ureases bacterianas; 3) deleção da metade C-terminal do peptídeo. Ensaios de formação de canais iônicos em bicamadas lipídicas artificiais com o jaburetox e mutantes mostraram que todos formam canais iônicos, ainda que com diferentes características. Bioensaios com o percevejo Oncopeltus fasciatus (injeção na hemocele) e leveduras mostraram que a região do grampo-beta não está envolvida nos efeitos do peptídeo nesses organismos, sendo que é a região Nterminal responsável pelas atividades inseticida e antifúngica do Jaburetox. / Urease (EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes, that are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms in plants. Our group described the insecticidal activity of canatoxin, an isoform of urease. This toxicity involves the release of an internal peptide of 10 kDa (pepcanatox), released by the hydrolytic action of cathepsins found in the susceptible insects gut. Based on the N-terminal sequence of pepcanatox, a corresponding fragment of 270 bp (jaburetox-2Ec) was cloned from the JBURE-II and expressed in Escherichia coli. This recombinant peptide Jaburetox-2Ec (carrying the V5 epitope and His tag) was tested against the insect Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus and Spodoptera frugiperda, and 100% mortality was observed in all the models after ingestion of micrograms of the peptide. Other data showed that Jaburetox-2Ec has the ability to interact with acidic lipid bilayers, liposomes leakage and also antifungal activity. Molecular modeling studies of the peptide revealed the presence of a β-hairpin motif, which could be involved in this toxicity. In order to identify structures involved in the biological activities, we chose a directed mutagenesis approach. For this, the jaburetox cDNA was cloned into pET-23a vector (to yield the expression of jaburetox containing only histidine tag), and from this, we obtained different mutants: 1) deletion of the entire β- hairpin motif (amino acids 61 -75); 2) deletion of the N-terminal half of the peptide, which corresponds to a region absent in bacterial ureases; 3) deletion of the C-terminal half of the peptide. Planar lipid bilayers experiments were performed with jaburetox and all mutants, and we observed channels activity in all cases. Bioassays with Oncopeltus fasciatus and Rhodnius prolixus showed that the region of β-hairpin is not involved in the effects of the peptide in these organisms, and the N-terminal region of the Jbtx carries the most important entomotoxic domain which is fully active in the absence of the β-hairpin motif.

none

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Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1948. / Vita. Typescript. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaf [36]).

Ureases são metaloenzimas dependentes de níquel, amplamente distribuída em bactérias, fungos e plantas. Estas enzimas atuam na catálise da hidrólise da ureia a amônia e dióxido de carbono. Proteus mirabilis é uma bactéria patogênica, produtora de urease, um de seus mais importantes fatores de virulência. Esta bactéria Gram-negativa se comporta como um uropatógeno oportunista responsável por severas infecções em pacientes hospitalizados. A amônia liberada pela hidrólise da ureia catalisada pela urease de Proteus mirabilis (PMU) causa um aumento no pH levando à formação de microclima, possibilitando a colonização do patógeno no trato urinário do hospedeiro. A PMU apresenta alta similaridade com outras ureases, como a urease de sementes de “Jack bean” (JBU) e a urease de Helicobacter pylori (HPU), para as quais nosso grupo descreveu diversas atividades biológicas que são independentes da hidrólise de ureia. Neste trabalho, nós produzimos PMU, e logo depois investigamos se esta, assim como a JBU e a HPU, apresenta atividades não relacionadas à atividade enzimática. As condições de cultivo para expressão da PMU expressa em Escherichia coli HB101 foram otimizadas pela metodologia de superfície de resposta. Concentrações de níquel, ureia e tempos de indução foram testados. A purificação da enzima recombinante foi obtida em 3 etapas cromatográficas. A primeira, uma HiTrapQTM HP (pH 7,5) onde a urease foi eluida com 400 mMol.L-1 de KCl. O pico das frações eluídas foram reunidas, dialisadas e aplicadas na coluna HiLoad 26/10 Q-SepharoseTM HP, usando o mesmo tampão e sal para eluição. As frações ativas foram novamente reunidas e a PMU foi submetida a cromatografia de gel filtração (Superdex 200TM 26/60-pg). A PMU apresenta estabilidade na faixa de pH 7,0 a 8,5, com seu pH ótimo estimado em 8,0. Alta atividade ureolítica pode ser detectada de 37 oC a 48 oC. Diferentes soluções salinas induzem o aumento na atividade enzimática desta urease, e quanto maior o tempo de exposição, maior a tendência a este aumento. Assim como a JBU, esta urease é capaz de inibir o crescimento de leveduras, mas diferentemente desta e da HPU, a PMU não apresenta atividade inibitória sobre a germinação de esporos e o crescimento de fungos filamentosos. As ureases de P. mirabilis e de H. pylori apresentam regiões de semelhança com o peptídeo proveniente do colágeno, e de acordo com testes de modelagem, esta região estaria exposta para interação com receptores localizados nas membranas de plaquetas, visto que ambas ativam plaquetas resultando na formação de agregados. / Ureases are Ni-dependent metalloenzymes, widespread in bacteria, fungi and plants, that catalyze the hydrolysis of urea into ammonium and carbon dioxide. The pathogenic bacteria Proteus mirabilis produces urease as virulence factor. Proteus mirabilis is a Gram negative opportunistic uropathogen, which causes severe infections in hospitalized patients. Ammonia released from urea hydrolysis by Proteus mirabilis urease (PMU) increases the local pH and forms a microclimate which allows the colonization of the host urinary tract. PMU presents high similarity to other ureases, such as that from Jack bean seeds (JBU) or from Helicobacter pylori (HPU), for which our group has described biological activities unrelated to urea hydrolysis. Here we aimed to investigate whether PMU shares with JBU and HPU other properties unrelated to enzyme activity. Growth conditions of PMU-expressing Escherichia coli HB101 were optimized by response surface methodology prior to purification. Concentrations of nickel, urea, and induction time were tested. A partially purified recombinant enzyme was obtained after 3 chromatographic steps. In the first, a HiTrapQTM HP (pH 7.5), urease eluted with 400 mMol.L-1 KCl. Peak fractions were pooled, dialyzed and loaded in a HiLoad 26/10 Q-SepharoseTM HP column using same buffer and eluting salt. The active fractions were pooled and PMU was submitted to gel filtration (Superdex 200TM26/60-pg). The enzyme was stable in the range of pH 7.0 up to 8.5, with optimum pH at 8.0. The ureolitic activity is high from 37 oC up to 48 oC. Different salts increased the ureolytic activity of PMU, the longer the exposition, the higher was the increase in activity. PMU inhibited yeast growth, similarly to the effect induced by JBU. Differently from JBU and HPU, this urease did not inhibit spore germination and growth of different filamentous fungi. Ureases from P. mirabilis and H. pylori presented regions of homology with collagen, and according to modeling tests, these region are exposed to receptor recognition localized in platelets membrane, which might explain their platelet aggregating effect.

O presente trabalho apresenta o estudo físico-químico da interação de lipossomas miméticos de plaquetas humanas (LM) com a urease de jack bean (JBU), bem como a interação com o surfactante Triton X-100. Realizou-se, também, um estudo físico-químico preliminar de LM com gangliosídeos (GG) em sua composição e a interação com a JBU e com o Triton X-100. Os LM foram preparados pelo método de evaporação em fase reversa. A interação da JBU e do Triton X-100 com os LM foi analisada pelas técnicas de Microscopia Óptica de Luz Polarizada (POM), Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS), Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS) e Velocimetria de Espalhamento de Luz (PZ). O estudo da interação de LM com a JBU revelou uma significativa mudança nas dimensões dos LM, que se mostrou mais pronunciada com uma maior concentração de JBU. Os dados de SAXS revelaram mudanças estruturais na membrana lipossômica, indicando que a JBU aumenta a distância de repetição lamelar, enquanto que o Triton X-100 diminui. Observou-se, também, uma mudança no potencial elétrico superficial dos LM na presença do JBU e do Triton X-100. Os LM com GG apresentaram um perfil de SAXS característico de lipossomas unilamerales, diferentemente dos LM sem GG, indicando que os GG foram incorporados na membrana. Os dados de SAXS sugerem que a JBU esteja interagindo com GG dos LM e não com a membrana lipossômica. / This work presents the physical-chemical study of platelets mimetic liposomes (LM) interaction with jack bean urease (JBU), as well as interaction with the surfactant Triton X-100. The preliminary physical-chemical study was carried out with LM content gangliosides (GG) in its composition and its interaction with JBU and Triton X-100. The LM were prepared by reverse phase evaporation. The interaction of JBU and Triton X-100 with LM was analyzed by Polarized Optical Microscopy (POM), Dynamic Light Scattering (DLS), Small Angle X-ray Scattering (SAXS) and Velocimetry Light Scattering (PZ). The study of the interaction of LM with JBU revealed a significant change in the LM dimensions, which was more pronounced with a higher concentration of JBU. The SAXS data indicate structural changes in the liposome membrane, indicating that the JBU cause an increase in the lamellar repeat distance, while the Triton X-100 decreases. The surface electric potential changed in the presence of JBU and Triton X-100 in the LM. The LM with GG showed a SAXS profile characteristic of unilamerales liposomes, unlike of LM without GG, indicating that the GG were incorporated into the membrane. The SAXS data suggest that JBU interacts with GG of the LM.

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são metaloenzimas distribuídas em plantas, fungos e bactérias. As duas isoformas de ureases de Canavalia ensiformis (canatoxina - CNTX e urease do feijão de porco - JBU) são altamente tóxicas para insetos de diferentes ordens. A toxicidade dessas proteínas é dependente da liberação de um fragmento de cerca de 10 kDa a partir da proteína nativa. Essa liberação se dá por ação das enzimas digestivas cisteínicas e aspárticas (tipo catepsina B e D) presentes no trato digestivo de algumas ordens de insetos. Ureases não são tóxicas para insetos com digestão baseada em enzimas serínicas (tipo tripsina). Esse peptídeo de 10 kDa foi isolado e caracterizado, recebendo o nome de Pepcanatox. Um peptídeo recombinante, equivalente ao Pepcanatox, foi expresso em Escherichia coli e chamado Jaburetox 2Ec. Jaburetox 2Ec é tóxico, por via oral, para ninfas de Dysdercus peruvianus e, por injeção toráxica, para ninfas de Rhodnius prolixus e ninfas e adultos de Triatoma infestans. CNTX e JBU, dados por via oral, são tóxicos para ninfas de D. peruvianus e R. prolixus, mas não são tóxicas para as formas adultas desses insetos.O processamento de CNTX e JBU por enzimas de ninfas e adultos de D. peruvianus mostraram um perfil distinto, podendo ser esse diferencial o responsável pela falta de efeito tóxico observado em adultos. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. Usando Callosobruchus maculatus como modelo, as enzimas responsáveis pelo processamento das ureases foram investigadas. A purificação parcial das enzimas de C. maculatus por gel-filtração resultou em uma fração (Pico B) capaz de liberar um peptídeo de aproximadamente 10 kDa a partir de CNTX e JBU. A atividade proteolítica do Pico B é completamente inibida por Pep-A e parcialmente inibida por E-64, indicando a presença de aspártico (majoritária) e cisteíno proteases. Observamos que tanto E-64 (inibidor de cisteíno proteinases) quanto Pepstatina-A (inibidor de aspártico proteinases) diminuem a formação do peptídeo entomotóxico pelo Pico B, sugerindo que cisteíno e aspártico proteases estão envolvidas nesse processo.O mecanismo de ação em insetos das ureases, assim como dos peptídeos derivados, ainda não é conhecido. Um efeito observado in vivo é a diminuição da taxa de perda de peso de R. prolixus após a alimentação com ureases, indicando uma possível alteração no sistema excretório. Para avaliar o efeito das ureases e de Jaburetox 2Ec na secreção de R. prolixus, realizamos ensaios de secreção de fluídos pelos túbulos de Malpighi isolados, assim como ensaios de contrações dos intestinos anterior e posterior e vaso dorsal. JBU e Jaburetox 2Ec inibem a secreção de fluídos por túbulos de Malpighi isolados, de maneira dose dependente. CNTX também tem efeito antidiurético, enquando a urease de Helicobacter pylori (HPU) não causa nenhuma alteração na secreção dos túbulos de Malpighi. Jaburetox 2Ec, mas não JBU, causa um aumento dos níveis de GMPc nos túbulos sendo esse o segundo mensageiro de sua ação.Metabólitos de eicosanóides e cálcio (intra e extracelular) influenciam a ação de JBU, mas não de Jaburetox 2Ec. Ensaios de potencial transepitelial realizados com túbulos de Malpighi indicaram que Jaburetox 2Ec, mas não JBU, alteram a ação de uma H+-ATPase presente na membrana dos túbulos, causando um desequilíbrio no transporte iônico e, como consequência, alteração na secreção de fluídos. Os dados obtidos não mostram que JBU e Jaburetox 2Ec desencadeiam rotas distintas nos túbulos de Malpighi, ambos culminando em antidiurese. Assim como nos túbulos de Malpighi, JBU diminui o transporte de fluídos pelo epitélio do estômago de R. prolixus. Jaburetox 2Ec e JBU causam um aumento na frequência de contrações do estômago estimuladas por serotonina. No intestino posterior, observamos que JBU também causa um aumento na frequência e amplitude das contrações, e mudança no tônus basal do tecido. No vaso dorsal, nenhuma alteração significativa nas contrações foram observadas. Também avaliamos por microscopia o efeito da alimentação com JBU na liberação de serotonina, hormônio envolvido em diversos processos fisiológicos. Não observamos nenhuma alteração significativa na liberação desse hormônio a partir das células do sistema nervoso, assim como nos órgãos controlados por serotonina. A liberação de fragmento(s) entomotóxico(s) a partir de ureases vegetais, assim como o mecanismo de ação dessas ureases e fragmentos, são processosbastante complexos. Nessa tese tivemos êxito em caracterizar várias etapas desses processos, esclarecendo pontos chaves e levantando evidências para guiar trabalhos futuros. / Ureases (E.C. 3.5.1.5) are metalloenzymes widespread in plants, fungi and bacteria. Two isoforms of Canavalia ensiformis urease, (canatoxin - CNTX and jack bean urease – JBU), are toxic to insects from different orders. The toxicity of these proteins is due to the release of a 10 kDa peptide from the native protein. This release is due to the action of acidic digestive enzymes present in the insect digestive tract. Ureases are not toxic to insects with digestion relying on trypsin-like enzymes. The entomotoxic peptide, called Pepcanatox, was isolated and characterized and a recombinant peptide, equivalent to Pepcanatox was expressed in Escherichia coli. Jaburetox 2Ec, the recombinant peptide, is toxic by oral route to nymphs of Dysdercus peruvianus and by injection to nymphs of Rhodnius prolixus and nymphs and adults of Triatoma infestans. CNTX and JBU, administered by oral route, are toxic to nymphs of D. peruvianus and R. prolixus, but are innocuous to adults of these insects. Proteolytic processing of JBU and CNTX by digestive enzymes from D. peruvianus nymphs and adults showed a distinct profile. This differential processing could be related to the lack of toxic effect of the proteins in adults.Using Callosobruchus maculatus as a model, the digestive enzymes involved in urease’s processing were investigated. The partial purification of C. maculatus enzymes resulted in a protein fraction (Pool B) capable of releasing a 10kDa peptide from JBU and CNTX. The proteolytic activity of Pool B was completely abolished by Pep-A and partially inhibited by E-64, indicating the presence of aspartic (majoritary) and cysteine proteinases. Both E-64 and Pep-A decrease the formation of the entomotoxic peptide, suggesting that both classes of enzymes may be involved in this process. The purification of the enzymes present on Pool B will clarify the role of each of these enzymes on urease processing and release of the entomotoxic peptide. The mechanisms of action of ureases as well as urease-derived peptides in insects is still poorly characterized. A lower rate of weight loss in R. prolixus fed on a urease-containing meal was observed in vivo, indicating a possible alteration on theexcretory system. To evaluate the effect of ureases and Jaburetox 2Ec on R. prolixus excretion, we performed fluid secretion assays on isolated Malpighian tubules, as well as fore- and hindgut contractions assays. JBU and Jaburetox 2Ec inhibit Malpighian tubules fluid secretion in a dose dependent fashion. CNTX is also antidiuretic, while Helicobacter pylori urease (HPU) does not alter the secretion rate. Jaburetox 2Ec, but not JBU, increases tubules levels of cGMP. No changes in AMPc was seen with either polypeptide. Eicosanoid metabolites and calcium (intra- and extracellular) modulate the antidiuretic effect of JBU, but not that of Jaburetox 2Ec. Measurements of the transepithelial potential in Malpighian tubules indicated that Jaburetox 2Ec, but not JBU, disrupts the activity of a H+-ATPase present on tubules’ membranes, causing changes in fluid secretion due to an imbalance of ions transport. The data obtained show that JBU and Jaburetox 2Ec are acting on Malpighian tubules through different pathways, both leading to antidiuresis. As seen in Malpighian tubules, JBU also decrease the fluid transport across the crop epithelium of R. prolixus. Jaburetox 2Ec and JBU cause an increase of the frequency of crop contractions stimulated with serotonin. In the hindgut, JBU increases the frequency and amplitude of contractions, and alters the muscle basal tonus. In the dorsal vessel, no significant alterations were observed. Using microscopy, we also evaluated the effect of JBU feeding in the release of serotonin, a hormone involved in several physiological processes. There is no alteration in the release of this hormone from nervous system cells, as well as in tissues regulated by serotonin. All these data indicate that JBU and its derived peptide cause major alterations of post feeding physiological process in R. prolixus that contribute to, or can be the cause of the entomotoxic effect. The release of entomotoxic fragment(s) from plant ureases and their mechanism of action are complex processes. Here, we were successful in characterizing several steps of these processes, clarifying crucial points and providing leads for future work in this field.