La faculté du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) à induire l'apoptose dans les cellules tumorales en fait un bon modèle d'étude. Mais contrairement au virus sauvage pour la protéine de la matrice M (TP6), certains mutants de M du VSV, comme T1026, induisent moins fortement l'apoptose. Ils peuvent également persister dans les cellules neurales humaines. Les études préalables ont montré que si la voie apoptotique intrinsèque est impliquée dans la mort cellulaire induite par le VSV, elle ne suffit pas à expliquer la totalité de la mortalité. D'autres voies apoptotiques sont donc impliquées. La calpaïne est une protéine cellulaire impliquée dans différentes voies métaboliques chez les cellules de vertébrés, dont l'apoptose. Cette cystéine protéase dépendante du calcium est particulièrement importante dans les cellules de type neural. L'infection virale d'une cellule pouvant induire une variation de la concentration en calcium cytosolique, la calpaïne peut être activée dès la phase précoce de l'infection et jouer un rôle à différents niveaux. Une fois activée, elle a la capacité de cliver le fodrine, protéine du cytosquelette, et ainsi participer aux changements morphologiques induits par le VSV. La calpaïne peut également cliver Bax, renforçant la voie apoptotique mitochondriale. Le rôle de la calpaïne a été étudié ici lors de l'infection in vitro par le VSV dans un neurogliome de type H4. L'analyse des protéines totales, extraites lors des phases précoces et tardives de l'infection par TP6 et T1026, ont pu être effectuées par immunobuvardage. De plus, des modifications dans la morphologie des cellules infectées ont été observées par microscopie optique. La présence de la calpaïne a été décelée dans la fraction cytosolique des cellules H4. Les deux mutants viraux utilisés ont montré un clivage de cette protéase tôt dans l'infection sans toutefois qu'une augmentation de la concentration en calcium cytosolique n'apparaisse. L'inhibition de la calpaïne a provoqué un ralentissement des changements morphologiques induits par TP6, mais le clivage de la fodrine n'a pu être mis en évidence étant donné l'absence de la forme classique de cette protéine dans les cellules H4. L'inhibition de la calpaïne a également permis de diminuer la mortalité cellulaire lors de la phase précoce de l'infection par TP6 (1-4h p.i). Cependant, cet effet se perd au cours de la phase tardive (16-18h p.i). Dans le cas de T1026, l'inhibition de la calpaïne n'a pas provoqué de différences, que ce soit dans les changements morphologiques ou dans la viabilité cellulaire. Entre 14h et 18h p.i. la pro-caspase-3 a été clivée, montrant ainsi l'apoptose induite par le VSV, et Bax a également été clivé en une sous-unité de 18 kDa, portion à caractère pro-apoptotique pouvant provenir de l'activité de la calpaïne. Les résultats montrent donc que cette protéase est impliquée dans l'infection par le VSV, tant dans les changements morphologiques que dans la mort cellulaire induits lors de l'infection. ______________________________________________________________________________

Différentes formes plus courtes de la protéine de la matrice (M) du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) peuvent être produites lors de l'infection de cellules in vitro à cause des phénomènes d'initiation interne de la traduction (Jayakar et Whitt, 2002) et de protéolyse (Rosen et al., 1983). L'objectif de la présente étude était de caractériser les formes plus courtes de M produites lors de l'infection de cellules par une souche sauvage du VSV (HR), ou par un variant (T1 026-R1) qui possède une mutation sur sa protéine M (M51R). Pour ce faire, des cellules HeLa, BHK-21 et L929 ont été infectées par ces deux variants lors d'expériences séparées. Des immunobuvardages et des tests de type «pulse-chase» ont permis d'observer l'existence d'au moins quatre formes de M à l'intérieur des cellules infectées (M1, M', M" et Mfc) et ce, indépendamment de la souche virale employée. Lors de l'infection des cellules par la souche sauvage du VSV (HR), les formes M" et Mfc pourraient être produites par initiation interne de la traduction aux positions 33 et 51 de M, respectivement. L'existence de la forme Mfc, ou d'une protéine de taille semblable, à l'intérieur des cellules infectées par T1026-R1, ne peut cependant pas être expliquée par un évènement d'initiation interne de la traduction en position 51 à cause de la mutation M51 R. L'origine de cette protéine pourrait être attibuable à l'action de la trypsine ou une autre protéase activée au cours de l'infection. Des expériences de «pulse-chase» en présence de l'inhibiteur z-VAD ont montré que l'apparition de Mfc pouvait dépendre de l'activation des cystéines protéases. L'analyse des séquences des différentes formes de M par dégradation de Edman et par spectrométrie de masse n'a pas permis d'identifier la portion manquante de la protéine. Aussi, afin de tenter de déterminer le rôle physiologique des formes de M produites par initiation interne de la traduction, des vecteurs d'expression inductible des gènes tronqués ont été construits. L'expression de ces protéines à l'intérieur de cellules HeLa transfectantes stables n'a pu être détectée. La protéase impliquée dans la production de la forme Mfc du mutant T1 026-R1 reste à identifier ainsi que le rôle des différentes formes plus courtes de la protéine M dans la cytopathogénèse et le cycle de réplication du VSV. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Virus stomatite vésiculeuse, Protéine matrice, Initiation interne de la traduction, Protéolyse.

La couche cornée, couche la plus superficielle de l'épiderme, assure une fonction de barrière multifonctionnelle vitale pour l'organisme. Le maintien de cette barrière dépend de la fonctionnalité des cellules sous-jacentes, les kératinocytes granuleux, dernière couche de cellules vivantes de l'épiderme. Les kératinocytes granuleux contiennent dans leur cytoplasme de nombreux organites tubulo-vésiculaires sécrétoires, appelés corps lamellaires (CL). Les CL jouent un rôle majeur dans la formation et le maintien de cette barrière en déversant leur contenu (lipides, lipases, protéases, inhibiteurs de protéases, peptides antimicrobiens,...) à la transition couche cornée - couche granuleuse. Le trafic intracellulaire des CL est donc un processus déterminant dans l'homéostasie de la couche cornée. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de ce trafic ne sont pas élucidés. Précédemment, au laboratoire, une analyse systématique par spectrométrie de masse des protéines associées aux CL a permis d'identifier plusieurs GTPases de la famille Rab et certains de leurs effecteurs. Ces protéines étant des régulateurs majeurs du trafic vésiculaire dans tous les types cellulaires, elles pourraient jouer un rôle dans le routage des CL et, ainsi, dans la fonctionnalité de la barrière épidermique. L'objectif de ma thèse était d'identifier les GTPases Rab et effecteurs impliqués dans la régulation du trafic intracellulaire des CL. Dans un premier temps, j'ai mis en évidence que la GTPase Rab11a est fortement exprimée dans les kératinocytes granuleux où elle est partiellement associée aux CL. J'ai montré que la déplétion de Rab11a dans un modèle tridimensionnel d'épiderme reconstruit in vitro réalisée grâce à la technique d'interférence à l'ARN, induit une diminution de la densité et de la sécrétion des CL. L'extinction de Rab11a entraîne également une baisse du taux de céramides et de cholestérol, une désorganisation des lipides intercornéocytaires et une augmentation de la perméabilité de la couche cornée. Dans les épidermes reconstruits déplétés, les composants des CL non-sécrétés sont adressés vers une voie de dégradation lysosomale. Dans un deuxième temps, j'ai observé que la perte d'expression de Rab11a induit une anomalie de distribution du moteur moléculaire Myosine-Vb, effecteur majeur de Rab11a. J'ai donc analysé les conséquences de la déplétion de Myosine-Vb dans les épidermes reconstruits et montré qu'elle induit un phénotype comparable à celui observé lors de la déplétion de Rab11a. L'ensemble de ces résultats suggèrent fortement que le complexe bipartite Rab11a-Myosine-Vb constitue un régulateur majeur de la biogenèse des CL et ainsi, de l'homéostasie de la barrière épidermique. Mon travail de thèse est la première étape du décryptage des voies moléculaires impliquées dans la biogenèse des CL et contribue à une meilleure compréhension du rôle du trafic intracellulaire dans la constitution de la barrière épidermique. Il pourrait permettre de caractériser les mécanismes physiopathologiques associés à un défaut de trafic des CL. / The stratum corneum, the most superficial layer of the epidermis, provides a multifunctional protective barrier which is vital for the organism. The maintenance of this barrier is directly dependent on the underlying granular keratinocytes which are the last living cells in the epidermis. The granular keratinocytes contain in their cytoplasm numerous tubulovesicular secretory organelles called lamellar bodies (LB). LB play a major role in the establishment and the maintenance of the epidermal barrier by releasing their content (lipids, lipases, proteases, protease inhibitors, antimicrobial peptides,...) at the junction between the stratum corneum and the stratum granulosum. Because of LB importance in the maintenance of the stratum corneum homeostasis, the regulation of their trafficking deserves further study.Previously, in my laboratory, a proteomic characterization of LB by mass spectrometry has identified several Rab family GTPases and some of their effectors. In any cell type, from yeast to human, Rab GTPases are considered as major regulator of vesicular trafficking. Thus, I postulated that these proteins could play a role in the regulation of LB routing in the cytoplasm of granular keratinocytes. In this context, the aim of my thesis was to determine which Rab GTPases and effectors are involved in this process. In a first step, I demonstrated that Rab11a is strongly expressed in granular keratinocytes where it is associated with LB. I showed that Rab11a silencing using RNA interference technique in an in vitro tridimensional model of reconstructed human epidermis induces a decrease of LB density and secretion in granular keratinocytes. The Rab11a depletion also leads to a decrease of ceramide and cholesterol level and a disorganization of intercorneocyte lipids, generating a defective epidermal barrier. In depleted reconstructed epidermis, there is a missorting of non-secreted LB components, driven to the lysosomal degradation pathway. In a second step, I observed that Rab11a silencing affects distribution of its effector, the molecular motor Myosin-Vb. So, I analyzed the consequences of Myosin-Vb depletion in the model of reconstructed epidermis and I demonstrated that the phenotype obtained is similar that of a Rab11a depleted epidermis. Taken together, these results strongly suggest that the bipartite complex Rab11a-Myosin-Vb is able to regulate the biogenesis of LB in granular keratinocytes. Thus, this molecular complex is a crucial regulator of the epidermal barrier homeostasis. My thesis work is a first step in the deciphering of the molecular pathway involved in LB biogenesis. It is a breakthrough in the comprehension that membrane dynamic in the granular keratinocytes is a major regulator of epidermal barrier. It may contribute to a better understanding of pathophysiological mechanisms related to dysregulated LB trafficking in skin diseases.

Le glutamate est accumulé dans des vésicules synaptiques par des transporteurs vésiculaires du glutamate appelés VGLUT1-3. VGLUT1 et VGLUT2 sont utilisés par les neurones glutamatergiques «classiques» corticaux et sous-corticaux. VGLUT3 est présent dans des sous-populations de neurones utilisant d’autres neurotransmetteurs que le glutamate. Dans la cochlée, VGLUT3 permet la transmission glutamatergique entre les cellules ciliées internes et les neurones du nerf auditif. Le travail mené par l’équipe du Pr Puel a permis de découvrir l’implication de VGLUT3 dans une pathologie héréditaire de l’audition chez l’Homme. Une mutation p.A211V du gène codant VGLUT3 humain est responsable d’une surdité progressive à transmission autosomique. Il s’agit de la première mutation d’un VGLUT associé à une pathologie humaine. Mon travail de thèse a consisté à caractériser l’impact de cette mutation sur le SNC d’une lignée de souris exprimant cette mutation. Nous avons observé que cette mutation avait des effets complexes sur VGLUT3. La mutation p.A211V entraine une baisse marquée de l’expression de VGLUT3 dans les terminaisons nerveuses qui semble liée à une dégradation accélérée de VGLUT3. 20% d’expression résiduelle de VGLUT3 suffisent à assurer la majeure partie des fonctions du transporteur. L’activité de VGLUT3 ne semble donc pas être linéairement corrélée à son expression. De plus, la réduction de VGLUT3 au niveau des synapses semble s’accompagner d’une réduction du nombre de vésicules VGLUT3-positives et d’une réduction du nombre de copies de VGLUT3 par vésicule. Dans l’ensemble, mon travail de thèse a permis d’acquérir une meilleure connaissance de la régulation de VGLUT3. / Glutamate is the major excitatory neurotransmitter in the Central Nervous System (CNS) and is accumulated into synaptic vesicles by proton-dependent transporters named VGLUT1-3. VGLUT1 and VGLUT2-positive neurons are respectively found in cortical and subcortical glutamatergic neurons. In contrast, VGLUT3 is localized in a small population of neurons using other neurotransmitter than glutamate i.e.: cholinergic interneurons in the striatum, subpopulation of GABAergic interneurons in the hippocampus and cortex and serotoninergic neurons. Furthermore, VGLUT3 is also expressed by sensory inner hear cells (IHCs).In the cochlea, VGLUT3 accumulates glutamate into synaptic vesicles of the IHCs. A mutation of the gene that encodes VGLUT3 is responsible for a progressive, high-frequency deafness. It is the first mutation of a VGLUT that was demonstrated to be responsible for a human pathology.We investigated the effects of the p.A211V mutation on VGLUT3 in the CNS of a mouse line expressing this mutation. We observed that this mutation had complex effects on VGLUT3. The p.A211V mutation causes a 80% decrease of VGLUT3 in nerve endings. 20% residual expression of VGLUT3 is sufficient to fulfill most part of its functions. Contrary to prevailing views, VGLUT3 global activity is not linearly correlated to VGLUT3 quantity. Futhermore, VGLUT3 reduction seems to be associated with a diminution of VGLUT3-positive vesicles accompanied by an homogenous reduction of VGLUT3 copy number per vesicle.Overall, my thesis allowed to acquire a better understanding of the regulation of VGLUT3. This work will deepen our understanding of the involvement of VGLUTs in various pathologies.

Résumé : La protéine Gα[indice inférieur]s est une GTPase hétérotrimérique, actrice principale de la signalisation intracellulaire couplée aux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Un de ses rôles majeurs est de transmettre l’activation d’un RCPG par un agoniste au niveau de la membrane plasmique, en signal intracellulaire, ceci grâce à un changement conformationnel dû à sa liaison à un GTP. En réponse, la protéine Gα[indice inférieur]s activera principalement la voie de l’AMP cyclique. Or, depuis quelques années, la protéine Gα[indice inférieur]s semble impliquée dans un tout autre phénomène intracellulaire, qu’est le trafic vésiculaire. En effet, sa localisation au niveau du compartiment endosomal laisse perplexe. Certains ont démontré le couplage de cette sous-unité avec des récepteurs internalisés, induisant une signalisation à partir de la membrane endosomale, tandis que d’autres ont démontré une implication de cette sous-unité au niveau du complexe de triage protéique présent sur la membrane endosomale. Ainsi, l’équipe du Dr Farquhar a démontré l’implication de Gα[indice inférieur]s avec la protéine hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HRS) dans la dégradation du récepteur à l’epidermal growth factor (EGF). A travers nos travaux, nous avons pu démontrer une implication générale de la sous-unité Gα[indice inférieur]s dans la régulation de la dégradation endosomale de nombreux récepteurs, comme les RCPG. Nous avons identifié deux complexes, un ubiquitine-indépendant et un ubiquitine-dépendant. Le premier, ubiquitine-indépendant, implique une interaction directe de la protéine Gα[indice inférieur]s avec les proteines GPCR associated sorting protein 1 (GASP-1) et dysbindin. Ces deux protéines ont déjà été démontrées comme étant indispensables à l’adressage du récepteur delta opioïde (DOP) vers le compartiment lysosomal. Nous avons identifié que GASP-1 et dysbindin font le lien entre Gα[indice inférieur]s et HRS, et induisent l’adressage aux lysosomes du récepteur DOP, via les complexes endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT). Le second complexe identifié, ubiquitine-dépendant, est spécifique au récepteur C-X-C motif receptor 4 (CXCR4). L’adressage de ce récepteur aux lysosomes fait intervenir de nombreuses enzymes ubiquitine-ligases ainsi que des enzymes déubiquitinases. Nous avons démontré que Gα[indice inférieur]s, via son interaction directe avec l’E3 ubiquitine ligase Deltex 3 like (DTX3L), module l’activation d’une autre E3 ubiquitine ligase atrophin-1 interacting protein 4 (AIP4) et influence l’état d’ubiquitination du complexe ESCRT0, ceci régulant la dégradation du récepteur CXCR4. Paradoxalement, nous avons pu remarquer que les complexes identifiés ne semblent pas affecter les récepteurs couplés à Gα[indice inférieur]s. En effet, les récepteurs connus pour être couplés à la protéine Gα[indice inférieur]s, d’un point de vue signalétique, n’ont pas leur trafic intracellulaire affecté par la déplétion de l’expression de la protéine Gα[indice inférieur]s. De plus, l’état d’activation de Gα[indice inférieur]s ne semble pas influencer ces complexes. / Abstract : The Gα[subscript]s protein is a heterotrimeric GTPase protein, lead actress of intracellular signaling coupled to G protein-coupled receptors (GPCR). One of its major role is to transmit the binding of a ligand on the GPCR at the plasma membrane in intracellular signaling, thanks to a conformational change due to binding to GTP. In response, the activated Gα[subscript]s protein will mainly stimulate the way of cyclic AMP. However, in recent studies, the Gα[subscript]s protein appears to be involved in other intracellular phenomenon, like vesicular trafficking, due to its location at the endosomal compartment. Some studies showed the coupling of this subunit with internalized receptors, inducing signaling from the endosomal membrane, while others have shown implication of this subunit in the protein sorting complex presents on the endosomal membrane. Thus, the team of Dr. Farquhar demonstrated the involvement of Gα[subscript]s protein with hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HRS) protein, in the epidermal growth factor receptor (EGFR) degradation. Through our study, we demonstrated a general involvement of Gα[subscript]s subunit in the regulation of endosomal degradation of many receptors, such as GPCRs. We identified two complexes, an ubiquitin-independent and an ubiquitin-dependent. The first, ubiquitin-independent one, involves a direct interaction of Gα[subscript]s protein with GPCR associated sorting protein 1 (GASP-1) and dysbindin. These two proteins have been previously shown to be essential for delta opioid receptor (DOP) targeting to the lysosomal compartment. We identified that GASP-1 and dysbindin make the link between Gα[subscript]s and HRS, and induce the DOP receptor addressing to lysosomes, via complexes with endosomal sorting complex required for transport (ESCRT). The second complex identified is the ubiquitin-dependent complex, which is specific to the CXC motif receptor 4 (CXCR4). The lysosomal sorting of this receptor involves many ubiquitin ligases and deubiquitinases enzymes. We demonstrated that Gα[subscript]s, through a direct interaction with the E3 ubiquitin ligase Deltex 3 like (DTX3L), modulates the activation of another E3 ubiquitin Atrophin-1 interacting protein ligase 4 (AIP4) and influences the ESCRT-0 ubiquitination pattern. This complex regulates the CXCR4 receptor degradation. Paradoxically, we observed that receptors coupled to Gα[subscript]s are not affected. Indeed, the receptors known to be coupled to the Gα[subscript]s protein have not their intracellular trafficking affected by Gα[subscript]s depletion. Moreover, Gα[subscript]s activation state does not seem to influence these complexes.

Les interneurones GABAergiques dans l’hippocampe forment de petites populations diverses de neurones inhibiteurs contrôlant le transfert d’informations dans de larges ensembles de cellules principales. Ils compensent leur infériorité numérique par de vastes arborisations axonales capables de maintenir une libération vésiculaire de GABA à haute fréquence, et d’ajuster précisément la balance entre excitation et inhibition pour différents régimes d’activité du réseau. Les petites synapses centrales contiennent un nombre limité de vésicules synaptiques dont le recyclage par endocytose est essentiel au maintien de la transmission pendant une activité répétée. Le remplissage en GABA de ces vésicules recyclées est dépendant d’un approvisionnement des terminaisons en GABA suffisant pour faire face à la demande de recyclage créée par l’activité. Nos résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes d’adaptation de l’approvisionnement aux besoins imposés par le recyclage vésiculaire selon le régime d’activité, ainsi qu’un couplage direct entre le cycle de neurotransmetteurs et le cycle vésiculaire. Nous montrons que les transporteurs de glutamine sont responsables d’une potentialisation de l’approvisionnement des varicosités en GABA lors d’une activité répétée, probablement par une augmentation du nombre de ces transporteurs à la membrane. En développant et en utilisant des paradigmes expérimentaux nouveaux, nous montrons que la régulation métabolique du cycle vésiculaire passe par une adaptation du pool de vésicules recyclantes à la disponibilité en neurotransmetteurs. La nature du senseur de cette régulation et sa localisation cytosolique ou luminale restent à déterminer / In the hippocampus, GABAergic interneurons represent only 10% of the neuronal population but are able to synchronize the activity of large neuronal networks. They compensate their numerical inferiority by a large axonal arborization to sustain synaptic activity at high frequency and adjust the balance between excitation and inhibition for different regime of activity. Since small central synapses contain a limited pool of vesicles, their recycling by endocytosis is essential to maintain transmission during repeated activity. The filling of recycling vesicles with GABA is dependent on its supply in terminals which should be adjusted to the demand imposed by vesicular recycling. Our results reveal new transporter mechanisms that adapt GABA supply to neuron activity, suggesting a direct coupling between the neurotransmitter and the vesicle cycles. We show that high recycling activity increases GABA supply, probably by increasing the number of glutamine transporters at the membrane. By developing and using FM5-95 and VGAT-pHluorin with a new experimental paradigm, we provide evidence for a metabolic regulation of the vesicle cycle that involves a dynamic adaptation of the recycling pool to the neurotransmitter availability. The nature of the sensor of this regulation and its cytosolic or luminal location remain to be determined.

La polarité cellulaire est un processus fondamental qui contrôle les spécificités fonctionnelle et physiologique de la plupart des cellules eucaryotes. Cette asymétrie intracellulaire repose sur l’existence de compartiments membranaires distincts, à la fois dans leur composition en protéines mais également en phosphatidyl-inositols (PIs). Ainsi, la mise en place et le maintien de la localisation asymétrique de modules multi-protéiques associés notamment aux protéines PAR sont essentiels pour l’élaboration des domaines de polarité cellulaire. Durant ma thèse, j’ai étudié les relations entre les protéines de polarité et les PIs dans le contrôle de la polarité cellulaire. Plus particulièrement, en utilisant la chambre ovarienne de Drosophile, j’ai cherché à caractériser la suite d’évènements qui en amont régule l’activité de la PIP5K, Skittles (SKTL), qui produit le PI(4,5)P2 et à caractériser les mécanismes moléculaires qui lient le PI(4,5)P2, SKTL et les protéines PAR dans le contrôle et le maintien de la polarité cellulaire. J’ai contribué à caractériser l’importance de PI(4,5)P2 majoritairement produit par SKTL, dans le maintien de la polarité apico-basale et lors de la morphogenèse des cellules folliculaires de la chambre ovarienne. Le PI(4,5)P2 assure la localisation apicale de PAR3 et le maintien des jonctions adhérentes, sans affecter la localisation de PAR1. Par une méthode de quantification précise, j’ai ensuite démontré dans l’ovocyte que SKTL et le PI(4,5)P2, probablement grâce au trafic vésiculaire, étaient requis pour à la fois l’accumulation à l’antérieur de PAR3 et son exclusion au postérieur qui se fait à partir du stade 9B. L’accumulation antérieure de PAR3 est également dépendante d’un transport Dynéine dépendant et de la kinase IKKε tandis que son exclusion postérieure dépendant des phosphorylations par PAR1. Enfin, j’ai également étudié les modifications post traductionnelles de SKTL et leur importance dans la polarité cellulaire. J’ai identifié la présence de palmitoylation et de phosphorylations dont certaines impliquent la kinase PAR1 et la phosphatase PP1. Ces phosphorylations pourraient avoir un lien avec le rôle de SKTL dans le trafic vésiculaire. Ces résultats permettent donc d’élucider certains mécanismes cellulaires qui contrôlent la mise en place et le maintien de la polarité des cellules en liant les PIs et les protéines PAR / Cell polarity is a fundamental process that controls cell’s functional and physiological specificities. This process relies on membranous compartments differently composed both on proteins and on phosphatidyl-inositols (PIs). Indeed, through their asymmetric localization, polarity proteins, such as the PAR proteins, are essentials to establish and maintain polarity of the cells. During my PhD, I studied the interplay between the polarity proteins and the PIs. Using the Drosophila egg chamber, as a model, I aimed to characterized the upstream events that regulate the PI(4,5)P2 producing kinase (PIP5K), Skittles (SKTL), activity and localization. I also studied the downstream molecular process that link the PI(4,5)P2, SKTL and the PAR proteins in cell polarity. I contributed to the characterization of the importance of PI(4,5)P2, mainly produced by SKTL in maintaining the apical-basal polarity and during the morphogenesis of the follicle cells. The PI(4,5)P2 is ensuring PAR3 and adherens junctions but not PAR1 proper localizations. Next, through a precise quantification method, I showed that SKTL and the PI(4,5)P2, probably via vesicular traffic, were also ensuring PAR3 proper localizations (anterior accumulation and stage 9B posterior exclusion) in the oocyte. PAR3 accumulation also relies on a Dynein mediated transport and the IKKε kinase while its posterior exclusion relies on PAR1 phosphorylation. Finally, I studied SKTL post translational modifications and their relevance on cell polarity. I identified palmitoylation and phosphorylations that are regulated by the kinase PAR1 and the phosphatase PP1. SKTL phosphorylations seem to be related to its role on the vesicular traffic. Altogether these results clarify some mechanisms involving both PIs and PAR proteins in cell polarity maintaining and establishment

Les syndécans forment une famille de quatre protéines transmembranaires qui sont substituées par l'héparane sulfate. Grâce à ces chaînes glucidiques extracellulaires, les syndécans contrôlent la signalisation d'une pléthore de facteurs de croissance et de molécules d'adhésion. Une autre caractéristique remarquable des syndécans est la conservation de leur domaine intracellulaire au cours de l'évolution. Ce domaine contient un motif C-terminal qui peut induire une interaction avec les protéines dites «PDZ». Les interactions PDZ sont promiscues et les protéines PDZ contrôlent divers aspects de la signalisation cellulaire et de la communication cellule-cellule. Quatre interactions syndecan-PDZ ont été décrites à ce jour et toutes ces interactions ont des effets drastiques sur le comportement des cellules. En particulier, il a été documenté que l'interaction syndécan-synténine a un impact sur le trafic intracellulaire de molécules de signalisation liant l’héparan sulfate. De plus, les syndécans et la synténine coopèrent dans le contrôle la biogenèse des exosomes, organites extracellulaires fonctionnant comme des médiateurs importants de la communication cellule-cellule (y compris dans différentes maladies systémiques comme le cancer). Le protéome humain compte 150 protéines PDZ qui contiennent 266 domaines PDZ. Dans ce travail, nous avons mis à jour la complexité de l'interactome syndecan-PDZ et testé son impact sur le trafic membranaire et sur la composition des vésicules extracellulaires. Notre travail ouvre la voie à une meilleure compréhension des réseaux moléculaires contrôlant la communication cellule-cellule en physio-pathologie. / Syndecans form a family of four transmembrane proteins that are substituted with heparan sulfate. By virtue of these extracellular carbohydrate chains, syndecans control the signaling of a plethora of growth factors and adhesion molecules. Another remarkable feature of syndecans is the conservation of their intracellular domain through evolution. This domain contains a C-terminal motif that can mediate interaction with PDZ proteins. PDZ interactions are promiscuous and PDZ proteins control various aspects of cell signaling and cell-cell communication. Four syndecan-PDZ interactions have been described so far and all these interactions have broad effects on cell behavior. In particular, it was documented that syndecan-syntenin interaction has impact on the intracellular trafficking of heparan sulfate cargo. Moreover syndecan-syntenin controls the biogenesis of exosomes, extracellular organelles emerging as important mediators of cell-cell communication in health and diseases. The human proteome contains 150 PDZ proteins and 266 PDZ domains. Here we started addressing the complexity of the syndecan-PDZ interactome and tested for its impact on membrane trafficking and on the composition of extracellular vesicles. Our work paves the way for a better understanding of the molecular mechanisms and networks controlling cell-cell communication in health and disease.

La réponse immunitaire primaire fait appel à l'interféron bêta (IFN-B), une cytokine produite lors d'infections virales. L'expression de l'IFN-B est positivement régulée par le facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et celui-ci est retenu au cytoplasme par l'inhibiteur kappa B alpha (IkBa). L'expression d'IFN-B s'effectue lorsque IkBa est dégradé suite à sa phosphorylation. Fait intéressant, l'IFN-B n'est pas induit par le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) sauvage, contrairement à son mutant pour la protéine matricielle M (M51R), T1026. De plus, TP6 est un mutant de VSV qui possède la séquence sauvage de M et qui induit fortement l'IFN-B. Ces informations pourraient suggérer qu'à l'opposé de sa forme mutante, VSV sauvage ne permet pas l'expression du gène du NF-kB et il ne désactive pas IkBa, par sa phosphorylation ou dégradation, ce qui empêcherait l'activation du gène de l'IFN-B. Cette hypothèse a été vérifiée en mesurant l'expression de l'ARNm du NF-kB par PCR en temps réel et la phosphorylation de IkBa par immunobuvardage (IB) lors d'infections de cellules HeLa (humaines) et L929 (murines). Les données de PCR montrent que l'infection des cellules L929 par le virus HR produit une diminution de l'expression de l'ARNm du NF-kB au début de l'infection tandis que le virus TP6 montre une augmentation du NF-kB. Les IB témoignent que la quantité de IkBa et de p-IkBa diminue dans les deux types cellulaires infectés par HR. T1026 amène une expression différente pour les deux formes de IkBa et pour les deux types cellulaires. Ces résultats montrent que l'infection par ces trois souches de VSV affecte différemment l'expression du NF-kB et la dégradation de IkBa, sans toutefois expliquer les différences d'induction de l'IFN-B. La régulation de l'IFN-B au cours de l'infection par VSV pourrait impliquer d'autres mécanismes que la régulation de NF-kB. La progression des études portant sur VSV est importante car il est oncolytique et il fait partie des moyens envisagés dans le futur pour combattre les cancers. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : VSV, IFN-B, NF-kB, IkBa

Le [18F]Fluoro-éthoxybenzovesamicol ([18F]FEOBV) a été identifié comme étant un des agents radioactifs les plus prometteurs pour l'imagerie du transporteur vésiculaire de l'acétylcholine en utilisant la tomographie par émission de positrons (TEP). Nous rapportons ici que cette approche est en mesure de détecter de subtiles pertes de terminaux cholinergiques, comme celles associés avec le vieillissement ou suivant la lésion partielle du noyau basal de Meynert (NBM). Vingt-et-un rats adultes ont été distribués également en trois groupes : 1) Rats âgés (18 mois); 2) Jeunes rats (3 mois); et 3) Rats avec une lésion unilatérale du NBM induite par une infusion locale de saporine-IgG 192. Pour les rats normaux et ceux avec lésion, la plus haute valeur de liaison du [18F]FEOBV a été observée dans le striatum, suivi de valeurs similaires dans le cortex frontal et le thalamus, puis de valeurs plus faibles pour les hippocampes et le cortex temporo-pariétal. Les rats avec lésion du NBM ont démontré une liaison de [18F]FEOBV diminuée principalement dans la partie ventrale du cortex frontal. Cette perte est plus importante du côté de la lésion, mais également présente dans la région homologue de l'hémisphère controlatéral. Le vieillissement a entraîné une diminution de liaison de [18F]FEOBV localisée dans les hippocampes. Le [18F]FEOBV semble être une marqueur très prometteur pour la quantification in vivo du transporteur vésiculaire de l'acétylcholine dans le cerveau; l'imagerie TEP avec cet agent permet la détection de réductions physiologique et pathologique de la densité des terminaisons cholinergiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Tomographie par émission de positrons, transporteur vésiculaire de l'acétylcholine, neurodégénérescence, vieillissement, saporine-IgG 192, [18F]Fluoro-éthoxybenzovesamicol