O vírus Mayaro (MAYV) é um Alphavirus artritogênico responsável por causar uma doença febril aguda com sintomas parecidos aos de Dengue não-hemorrágica, porém com o agravante, como a febre Chikungunya, de ocorrência de artralgia. Os dados epidemiológicos disponíveis ainda são poucos devido à falta de diagnóstico adequado, pois algumas das técnicas desenvolvidas apresentam dificuldades quanto à coleta de amostra, devido à curta viremia, e ao background que interfere na interpretação dos resultados, subestimando o real número dos casos de infecção. Isso é preocupante principalmente em tempos de co-circulação de outras arboviroses como Dengue, Zika e Chikungunya. Neste trabalho desenvolvemos um método de imunofluorescência indireta dirigido à detecção de anticorpos contra a glicoproteína E2 do vírus Mayaro expressa em células S2 de Drosophila melanogaster. / Mayaro virus (MAYV) is an arthritogenic Alphavirus responsible for causing an acute febrile illness with symptoms similar to non-hemorrhagic Dengue, but with the aggravation, as Chikungunya fever, to develop arthralgia. The epidemiological data available still are few due to lack of proper diagnosis, because some of the techniques developed present difficulties regarding sample collection, due to the short viremia, and background that interferes with the interpretation of the results, underestimating the actual number of cases. This is a concern especially in periods of co-circulation of many other socioeconomic impact arboviruses, such as Dengue, Zika and Chikungunya. In this work we developed an indirect immunofluorescence method to the detection of antibodies against Mayaro E2 glycoprotein expressed in Drosophila melanogaster S2 cells.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-30T14:39:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-30T14:39:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-30T14:39:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) Previous issue date: 2017-09-04 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Dengue is currently considered the most important arbovirose. Its main vector is the mosquito Aedes aegypti, present in several regions around the world. The serological diagnosis by means of the NS1 antigen search is the one that has greater applicability, because of easy of execution and the window for detection between the 1st and the 9th day of the onset of symptoms, with a higher frequency until the 5th day. This study aimed to investigate the presence of dengue virus in samples with non-reactive results for the NS1 antigen, assessing if there was a failure in laboratorial diagnosis, or the existence of other arboviruses circulating in the state of Amazonas. Using the RT-qPCR technique, the presence of dengue virus was investigated in 306 serum samples from patients with clinical suspicion of infection. The samples that remained negative were investigated for the presence of the Zika (ZIKV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) and Oropouche (OROV) viruses with the same methodology, as well as the presence of IgG and IgM for dengue virus by ELISA. Of the 306 analyzed samples, 17 (5.5%) were positive for DENV, with three sequenced for serotype 4. Thirty-four (10.8%) were positive for ZIKV, one (0.3%) for CHIKV, thirteen 4.2%) for MAYV and nine (2.9%) for OROV. In relation to the NS1 test, all kits evaluated presented 100% agreement in negativity. For the screening of anti-DENV antibodies of the IgG class, of the 306 samples tested 134 (43.8%) had positive results. Regarding the detection of the IgM antibody, different positivities were observed for commercial kits: VIRION (n = 250) 35.6% positive; FOCUS (n = 105) 10.5% positive and PANBIO (N = 80) 20% positive. Our results confirm cases of false negative results for the NS1 tests of three commercial kits, in addition to the circulation of other arboviruses among patients from different municipalities in the state of Amazonas. / A dengue é considerada atualmente a mais importante arbovirose. O seu principal vetor é o mosquito da espécie Aedes aegypti, presente em diversas regiões do mundo. O diagnóstico sorológico por meio da pesquisa do antígeno NS1 é o que tem maior aplicabilidade, pela baixa complexidade na execução e por ser detectado entre o 1º e 9º dia de início dos sintomas, porém com frequência maior até o 5º dia. Esse estudo teve por objetivo principal investigar a presença do vírus dengue em amostras com resultados “Não Reagentes” para o antígeno NS1, avaliando se houve falha no diagnóstico laboratorial, ou a existência de outros arbovírus circulando no estado do Amazonas. Utilizando a técnica de RT-qPCR, pesquisou-se a presença do vírus dengue em 306 amostras de soros de pacientes com suspeita clínica de infecção. As amostras que continuaram negativas foram pesquisadas quanto a presença dos vírus Zika (ZIKV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) e Oropouche (OROV), pela mesma metodologia, bem como foi pesquisada a presença de anticorpos das classes IgG e IgM para o vírus dengue por ELISA. Das 306 amostras analisadas 17 (5,5%) foram positivas para DENV, com três sequenciadas para o sorotipo 4. Trinta e quatro (10,8%) foram positivas para o ZIKV, uma (0,3%) para CHIKV, treze (4,2%) para MAYV e nove (2,9%) para OROV. Em relação ao teste NS1 todos os kits avaliados apresentaram 100% de concordância em negatividade. Para a pesquisa de anticorpos anti-dengue da classe IgG, das 306 amostras testadas 134 (43,8%) tiveram resultados positivos. Em relação à detecção do anticorpo IgM foram observadas diferentes positividades para os kits comerciais: VIRION (n=250) 35,6% positivas; FOCUS (n=105) 10,5% positivas e PANBIO (N=80) 20% positivas. Nossos resultados confirmam casos de resultados falso-negativos, para os testes NS1 de três kits comerciais, além da circulação de outros arbovírus entre os pacientes de diferentes municípios do estado do Amazonas.

Recentemente, vários arbovírus têm acometido a população de países emergentes ocasionando sérios problemas de saúde pública, como as doenças causadas pelos vírus da dengue, Chikungunya, Zika e febre amarela. Um vírus emergente e já circulante no Brasil, chamado Mayaro (MAYV), do mesmo gênero do Chikungunya (Alphavirus), possui potencial prejudicial semelhante a esses já estabelecidos. Seu vetor de transmissão é o mosquito do gênero Haemagogus, característico de regiões isoladas, principalmente florestas. Entretanto, estudos demonstraram que o Aedes aegypti é um competente vetor desse agente, o que possibilita sua disseminação em regiões urbanas. O presente trabalho avaliou a expressão das proteínas estruturais do vírus Mayaro (E1, E2, E3, C e 6K), utilizando dois sistemas de expressão distintos, um baseado na levedura Pichia pastoris, e outro derivado de Baculovírus (BEVS). Essa estratégia foi estabelecida para que a expressão dessas proteínas promova a formação de partículas semelhantes ao vírus (virus like particles), estruturas multiprotéicas que mimetizam a conformação de uma partícula viral podendo ser utilizada como um candidato vacinal. O trabalho evidenciou a correta obtenção de organismos recombinantes em ambos os sistemas, com a avaliação da expressão sendo feita com técnicas de dot blot, western blot e imunofluorescência indireta (IFI). Com o sistema baculovírus, foram avaliadas as linhagens Sf-9 e Hi-5, sendo evidenciada a expressão de proteínas do MAYV em ambas, utilizando MOI 10 e tempos pós-infecção de 96 e 72 h, respectivamente. A correta expressão das proteínas de MAYV também foi evidenciada com a levedura Pichia pastoris, com cultivo a 30 °C e tempo de análise 48 h após indução. A geração de VLPs foi avaliada em amostras de sobrenadantes de ambos os sistemasapós a concentração por ultracentrifugação em gradiente de iodixanol, e análise por microscopia eletrônica de transmissão, sendo observadas nos dois sistemas com tamanhos variando entre 30-60 nm. Os resultados desse projeto podem gerar ferramentas importantes no desenvolvimento de kits diagnósticos e métodos vacinais contra o MAYV. / Recently, several arboviruses have affected emerging countries causing serious public health problems, such as diseases caused by dengue viruses, Chikungunya, Zika and yellow fever. An emerging and already circulating virus in Brazil, called Mayaro (MAYV), of the same genus of Chikungunya (Alphavirus), has harmful potential similar to those already established. Its transmission vector is the mosquito of the genus Haemagogus, characteristic of isolated regions, mainly forests. However, studies have demonstrated that Aedes aegypti is a competent vector of this agent, which would allow its dissemination in urban areas. The present work evaluated the expression of the structural proteins of the Mayaro virus (E1, E2, E3, C and 6K) using two distinct expression systems, one based on the yeast Pichia pastoris and another derived from Baculovirus (BEVS). The strategy of expressing structural proteins has been established so that the expression of these proteins promotes the formation of viruslike particles or VLPs, multiprotein structures that mimic the conformation of a viral particle and can be used as a vaccine candidate. The work evidenced the correct obtaining of recombinant organisms in both systems, with the evaluation of the expression being done with dot blot, western blot and indirect immunofluorescence (IFI) techniques. With the baculovirus system, the Sf-9 and Hi-5 strains were evaluated, and the expression of the MAYV proteins was evidenced in both, using MOI 10 and the time of post-infection analysis of 96 and 72 h, respectively. Correct expression of MAYV proteins was also evidenced with yeast Pichia pastoris, with culture at 30 ° C and analysis time 48 h after induction. The generation of VLPs was evaluated in both supernatants after concentration by iodixanol gradient ultracentrifugation and transmission electron microscopy analysis, being observed in both systems with sizes ranging from 30-60 nm. The results of this project can generate important tools in the development of diagnostic kits and vaccine methods against the MAYV.