No grupo das doenças infecciosas emergentes e reemergentes, os arbovírus transmitidos por mosquitos, são considerados importantes desafios para a saúde pública. O alastramento mundial do vírus Chikungunya (CHIKV, Togaviridae, Alphavirus), acabou resultando na introdução do CHIKV no Brasil, através da transmissão zoonótica por mosquitos do gênero Aedes spp, particularmente Ae. aegypti e Ae. albopictus, duas espécies invasoras e cosmopolitas. Outro Alphavirus, o vírus Mayaro (MAYV) presente na região amazônica da América do Sul, vem apresentando indícios de uma real urbanização, elevando a preocupação sobre sua possível transmissão por mosquitos urbanos. Diante desse cenário, fica clara a necessidade da realização de estudos sobre estratégias de controle e prevenção da infecção por MAYV e CHIKV, uma vez que não há vacinas ou terapia antiviral específica para a infecção por esses arbovírus. Este projeto descreve pela primeira vez a eficiente expressão, purificação e análise de partículas semelhantes a vírus (VLP, virus-like particles) dos Alphavirus CHIKV e MAYV em células de inseto S2 (Drosophila melanogaster). Para esse fim, clonamos os genes das proteínas estruturais dos vírus MAYV e CHIKV em vetores para a expressão recombinante em células S2. Essa plataforma de expressão de proteínas provou ser adequada para o processamento de glicoproteínas do CHIKV e MAYV para produção de VLP, uma vez que detectamos a presença de partículas no sobrenadante do cultivo por Western blotting e Microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Ainda, foi possível selecionar células para uma maior produção de VLP e estabelecer um método de purificação das partículas. / In the group of emerging and reemerging infectious diseases, mosquito-borne arboviruses are considered major public health challenges. The transmission of Chikungunya (CHIKV, Togaviridae, Alphavirus) in America continent was first reported in Central America and Caribbean region The CHIKV epidemics reached Brazil through zoonotic transmission by Aedes spp mosquitoes, particularly Ae. Aegypti and Ae. albopictus, two invasive and cosmopolitan species. Another Alphavirus, the Mayaro virus (MAYV) present mainly in the Amazon region has been showing evidence of a real urbanization, increasing concerns about its transmission by urban mosquitoes. Therefore, it is clear that studies on strategies for the control and prevention of MAYV and CHIKV infection are needed. Currently no vaccines or antiviral therapy specific for CHIKV and MAYV infection are available. This work describes for the first time an efficient expression, purification and analysis of virus-like particles (VLP) of CHIKV and MAYV Alphaviruses in S2 (Drosophila melanogaster) insect cells. The genes coding for the structural proteins of the MAYV and CHIKV viruses were cloned into vectors for recombinant expression in S2 cells. This platform proved to be suitable for the processing of CHIKV and MAYV glycoproteins and to produce VLP, since we detected the presence of particles in the culture supernatant by Western blotting and Transmission Electron Microscopy (TEM). Furthermore, it was possible to select cells for greater production of VLP and to establish a method for particle purification.

O vírus Mayaro (MAYV) é um Alphavirus artritogênico responsável por causar uma doença febril aguda com sintomas parecidos aos de Dengue não-hemorrágica, porém com o agravante, como a febre Chikungunya, de ocorrência de artralgia. Os dados epidemiológicos disponíveis ainda são poucos devido à falta de diagnóstico adequado, pois algumas das técnicas desenvolvidas apresentam dificuldades quanto à coleta de amostra, devido à curta viremia, e ao background que interfere na interpretação dos resultados, subestimando o real número dos casos de infecção. Isso é preocupante principalmente em tempos de co-circulação de outras arboviroses como Dengue, Zika e Chikungunya. Neste trabalho desenvolvemos um método de imunofluorescência indireta dirigido à detecção de anticorpos contra a glicoproteína E2 do vírus Mayaro expressa em células S2 de Drosophila melanogaster. / Mayaro virus (MAYV) is an arthritogenic Alphavirus responsible for causing an acute febrile illness with symptoms similar to non-hemorrhagic Dengue, but with the aggravation, as Chikungunya fever, to develop arthralgia. The epidemiological data available still are few due to lack of proper diagnosis, because some of the techniques developed present difficulties regarding sample collection, due to the short viremia, and background that interferes with the interpretation of the results, underestimating the actual number of cases. This is a concern especially in periods of co-circulation of many other socioeconomic impact arboviruses, such as Dengue, Zika and Chikungunya. In this work we developed an indirect immunofluorescence method to the detection of antibodies against Mayaro E2 glycoprotein expressed in Drosophila melanogaster S2 cells.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In this work we presented the idea to perform excision assays using the piggyBac transposable element as enzyme supplier and the inverted terminal sequences of the element, both necessary for mobilization of a transposable element. Drosophila S2 cells were electroporated to perform insertion of two different plasmids in the cytoplasm of cells, a plasmid carrying the terminal inverted repeats of piggyBac element flanking a GFP gene and other with the transposase coding sequence enzyme which recognizes the terminal inverted repeats, excise of the region where the element is and insert it into another locus. This is a vector-helper system, in which a fragment is excised from a plasmid with the help of the transposase located in the other. Conventional PCR was used to verify excision events showing a 200bp amplification region where the fragment was excised and a region 3kb amplification reagion at times when the fragment was full, ie, it has not mobilized. The qPCR technique was used to quantify the excision of this fragment, carrying out comparisons of the amount of plasmid DNA recovered from the S2 cells after the end of experiment with serial dilutions of the original plasmids carrying the ITRs, which was used as standard. The results showed that the technique involving electroporation and qPCR is feasible and can be used to quantify mobilization of transposable elements. Paralleling with existing tools for this type of quantification, qPCR shows up as a very sensitive technique of detection mobilization, as well as a low cost technique budget. / Neste trabalho apresentamos a ideia de realizar ensaios de excisão utilizando o elemento transponível piggyBac como fornecedor da enzima e das sequências terminais invertidas do elemento, ambos necessários para mobilização. Células S2 de Drosophila melanogaster foram eletroporadas para que houvesse inserção de dois diferentes plasmídeos no citoplasma das células, um plasmídeo portando as repetições terminais invertidas do elemento piggyBac flanqueando um gene GFP e o outro com a sequência codificadora da enzima transposase, a qual reconhece as repetições terminais invertidas e excisa o elemento da região onde está inserido, num sistema vector-helper, em que um fragmento é excisado de um plasmídeo com ajuda da transposase localizada no outro. PCR convencional foi usado para verificar os eventos de excisão, mostrando uma região de amplificação de 200pb nos casos de excisão do fragmento e uma região amplicada de 3kb, nas ocasiões em que o fragmento ficou inteiro, ou seja, não foi mobilizado. A qPCR foi utilizada para quantificar a excisão desse fragmento, realizando comparações da quantidade de DNA plasmidial recuperado das células S2 após o término do experimento com diluições em série do plasmídeo com as ITRs, que foi utilizado como standard. Os resultados mostraram que a técnica envolvendo eletroporação e qPCR é exequível e pode ser utilizada para quantificar mobilização de elementos transponíveis. Fazendo um paralelo com as ferramentas já existentes para esse tipo de quantificação, qPCR mostra-se como uma técnica bastante sensível de detecção de mobilização, bem como uma técnica de baixo custo orçamentário.

A glicoproteína do vírus rábico (RVGP) é o antígeno capaz de induzir a formação de anticorpos neutralizantes e a resposta imune protetora contra a infecção pelo vírus rábico. Estudamos as cinéticas de expressão da RVGP e de seu RNA mensageiro (RVGPmRNA) em dois sistemas distintos de expressão recombinante: células de Drosophila melanogaster (S2) e células BHK-21 infectadas com vírus Semliki Forest Virus (SFV). Para isso, fizemos um trabalho de padronização do tratamento de amostras de cultivos celulares, adequando-as a um teste de ELISA para dosagem da RVGP e estabelecemos um método de RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) para a dosagem do RVGPmRNA. Desenvolvemos também um novo método de titulação de partículas SFV por qRT-PCR, aplicável a praticamente qualquer construção de SFV recombinante. Em ensaios preliminares, as preparações de RVGP recombinante utilizadas para a imunização de camundongos foram capazes de induzir a formação de anticorpos neutralizantes e de conferir um bom grau de proteção ao teste de desafio intracerebral com vírus rábico. / The rabies virus glycoprotein is the major antigen able to induce a neutralizing antibody response and survival after challenge against rabies virus infection. We have studied the kinetic expression of RVGP and its messenger RNA (RVGPmRNA) in two different recombinant expression systems: stably transfected Drosophila melanogaster cells (rS2) and BHK-21 cells infected with Semliki Forest Virus carrying RVGP genetic information (SFV-RVGP). We have done a work of standardization of the cell culture samples treatment prior to RVGP quantification by ELISA, and we have developed and standardized a quantitative RT-PCR (qRT-PCR) to quantify the RVGPmRNA. We have also developed a new method of SFV particles titration by qRT-PCR, which is applicable to other constructions of recombinant SFV. We utilized the RVGP expressed by rS2 and SFV-RVGP systems on preliminary in vivo assays. The RVGP samples used to mice immunization were able to induce neutralizing antibodies and to lead to a nice level of protection against the intracerabral rabies virus challenge.

A glicoproteína do vírus rábico (RVGP) é o antígeno capaz de induzir a formação de anticorpos neutralizantes e a resposta imune protetora contra a infecção pelo vírus rábico. Estudamos as cinéticas de expressão da RVGP e de seu RNA mensageiro (RVGPmRNA) em dois sistemas distintos de expressão recombinante: células de Drosophila melanogaster (S2) e células BHK-21 infectadas com vírus Semliki Forest Virus (SFV). Para isso, fizemos um trabalho de padronização do tratamento de amostras de cultivos celulares, adequando-as a um teste de ELISA para dosagem da RVGP e estabelecemos um método de RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) para a dosagem do RVGPmRNA. Desenvolvemos também um novo método de titulação de partículas SFV por qRT-PCR, aplicável a praticamente qualquer construção de SFV recombinante. Em ensaios preliminares, as preparações de RVGP recombinante utilizadas para a imunização de camundongos foram capazes de induzir a formação de anticorpos neutralizantes e de conferir um bom grau de proteção ao teste de desafio intracerebral com vírus rábico. / The rabies virus glycoprotein is the major antigen able to induce a neutralizing antibody response and survival after challenge against rabies virus infection. We have studied the kinetic expression of RVGP and its messenger RNA (RVGPmRNA) in two different recombinant expression systems: stably transfected Drosophila melanogaster cells (rS2) and BHK-21 cells infected with Semliki Forest Virus carrying RVGP genetic information (SFV-RVGP). We have done a work of standardization of the cell culture samples treatment prior to RVGP quantification by ELISA, and we have developed and standardized a quantitative RT-PCR (qRT-PCR) to quantify the RVGPmRNA. We have also developed a new method of SFV particles titration by qRT-PCR, which is applicable to other constructions of recombinant SFV. We utilized the RVGP expressed by rS2 and SFV-RVGP systems on preliminary in vivo assays. The RVGP samples used to mice immunization were able to induce neutralizing antibodies and to lead to a nice level of protection against the intracerabral rabies virus challenge.