Objective: To describe frequency and clinical characteristics of MAYV infection in Piura, as well as the association of this pathogen with DENV. Results: A total of 86/496 (17.3%) cases of MAYV were detected, of which 54 were MAYV mono-infection and 32 were co-infection with DENV, accounting for 10.9% and 6.4%, respectively. When evaluating monoinfection by MAYV the main groups were 18–39 and 40–59 years old, with 25.9% and 20.4% respectively. Co-infections were more common in the age group 18–39 and those > 60 years old, with 34.4% and 21.9%, respectively. The most frequent clinical presentation were headaches (94.4%, 51/54) followed by arthralgias (77.8%, 42/54). During the 8-month study period the most cases were identified in the months of May (29.1%) and June (50.0%). / National Research Foundation of Korea / Revisión por pares

No grupo das doenças infecciosas emergentes e reemergentes, os arbovírus transmitidos por mosquitos, são considerados importantes desafios para a saúde pública. O alastramento mundial do vírus Chikungunya (CHIKV, Togaviridae, Alphavirus), acabou resultando na introdução do CHIKV no Brasil, através da transmissão zoonótica por mosquitos do gênero Aedes spp, particularmente Ae. aegypti e Ae. albopictus, duas espécies invasoras e cosmopolitas. Outro Alphavirus, o vírus Mayaro (MAYV) presente na região amazônica da América do Sul, vem apresentando indícios de uma real urbanização, elevando a preocupação sobre sua possível transmissão por mosquitos urbanos. Diante desse cenário, fica clara a necessidade da realização de estudos sobre estratégias de controle e prevenção da infecção por MAYV e CHIKV, uma vez que não há vacinas ou terapia antiviral específica para a infecção por esses arbovírus. Este projeto descreve pela primeira vez a eficiente expressão, purificação e análise de partículas semelhantes a vírus (VLP, virus-like particles) dos Alphavirus CHIKV e MAYV em células de inseto S2 (Drosophila melanogaster). Para esse fim, clonamos os genes das proteínas estruturais dos vírus MAYV e CHIKV em vetores para a expressão recombinante em células S2. Essa plataforma de expressão de proteínas provou ser adequada para o processamento de glicoproteínas do CHIKV e MAYV para produção de VLP, uma vez que detectamos a presença de partículas no sobrenadante do cultivo por Western blotting e Microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Ainda, foi possível selecionar células para uma maior produção de VLP e estabelecer um método de purificação das partículas. / In the group of emerging and reemerging infectious diseases, mosquito-borne arboviruses are considered major public health challenges. The transmission of Chikungunya (CHIKV, Togaviridae, Alphavirus) in America continent was first reported in Central America and Caribbean region The CHIKV epidemics reached Brazil through zoonotic transmission by Aedes spp mosquitoes, particularly Ae. Aegypti and Ae. albopictus, two invasive and cosmopolitan species. Another Alphavirus, the Mayaro virus (MAYV) present mainly in the Amazon region has been showing evidence of a real urbanization, increasing concerns about its transmission by urban mosquitoes. Therefore, it is clear that studies on strategies for the control and prevention of MAYV and CHIKV infection are needed. Currently no vaccines or antiviral therapy specific for CHIKV and MAYV infection are available. This work describes for the first time an efficient expression, purification and analysis of virus-like particles (VLP) of CHIKV and MAYV Alphaviruses in S2 (Drosophila melanogaster) insect cells. The genes coding for the structural proteins of the MAYV and CHIKV viruses were cloned into vectors for recombinant expression in S2 cells. This platform proved to be suitable for the processing of CHIKV and MAYV glycoproteins and to produce VLP, since we detected the presence of particles in the culture supernatant by Western blotting and Transmission Electron Microscopy (TEM). Furthermore, it was possible to select cells for greater production of VLP and to establish a method for particle purification.

O vírus Mayaro (MAYV) é um Alphavirus artritogênico responsável por causar uma doença febril aguda com sintomas parecidos aos de Dengue não-hemorrágica, porém com o agravante, como a febre Chikungunya, de ocorrência de artralgia. Os dados epidemiológicos disponíveis ainda são poucos devido à falta de diagnóstico adequado, pois algumas das técnicas desenvolvidas apresentam dificuldades quanto à coleta de amostra, devido à curta viremia, e ao background que interfere na interpretação dos resultados, subestimando o real número dos casos de infecção. Isso é preocupante principalmente em tempos de co-circulação de outras arboviroses como Dengue, Zika e Chikungunya. Neste trabalho desenvolvemos um método de imunofluorescência indireta dirigido à detecção de anticorpos contra a glicoproteína E2 do vírus Mayaro expressa em células S2 de Drosophila melanogaster. / Mayaro virus (MAYV) is an arthritogenic Alphavirus responsible for causing an acute febrile illness with symptoms similar to non-hemorrhagic Dengue, but with the aggravation, as Chikungunya fever, to develop arthralgia. The epidemiological data available still are few due to lack of proper diagnosis, because some of the techniques developed present difficulties regarding sample collection, due to the short viremia, and background that interferes with the interpretation of the results, underestimating the actual number of cases. This is a concern especially in periods of co-circulation of many other socioeconomic impact arboviruses, such as Dengue, Zika and Chikungunya. In this work we developed an indirect immunofluorescence method to the detection of antibodies against Mayaro E2 glycoprotein expressed in Drosophila melanogaster S2 cells.

Devido a existência de 2 alphavírus artritogênicos no Brasil, os vírus Mayaro (MAYV) e Chikungunya (CHIKV) tornou-se importante desenvolver testes diagnósticos eficazes para discriminar suas infecções. No presente trabalho, desenvolvemos ELISAs indiretos para diagnóstico de CHIKV e MAYV utilizando proteínas de envelope viral E2 recombinantes, produzidas em Escherichia coli, as rE2-CHIKV e rE2-MAYV ELISAs. As proteínas E2 recombinantes tiveram suas antigenicidades verificadas nos ensaios utilizando anticorpos policlonais oriundos de camundongos hiperimunizados com CHIKV, MAYV e outros alphavírus. O rE2-CHIKV ELISA detectou anticorpos murinos de forma homotípica e não produziu reações cruzadas evidenciáveis utilizando anticorpos murinos específicos contra outros Alphavírus. O rE2-MAYV ELISA detectou anticorpos murinos homotípicos e também, reagiu cruzadamente com anticorpos murinos anti-CHIKV, mas não para outros Alphavírus. Esses ELISAs, também, foram usados na detecção de anticorpos em soros de pacientes com suspeita de infecção arboviral. Pelo o rE2-CHIKV ELISA, testaram-se 59 soros, resultando em 26 amostras IgG positivas. Resultados desse ELISA, quando comparados aos obtidos por teste de neutralização, demonstraram sensibilidade de 89,66% e especificidade de 100%. Soros humanos IgG positivos foram detectados em altas diluições pelo rE2-CHIKV ELISA. Quanto a detecção de IgM, o rE2- CHIKV ELISA apresentou moderada concordância com outros ensaios sorológicos. Com rE2- MAYV ELISA, testaram-se 68 soros resultando em 23 amostras IgG positivas, das quais 11 também mostraram-se positivas em teste de neutralização, demonstrando sensibilidade de 100% e especificidade de 78,95%. Portanto, os rE2-CHIKV e rE2 MAYV ELISAs, particularmente para detecção de IgG, mostraram-se adequadamente sensíveis e específicos para serem validados em estudos com maiores números de amostras e serem aplicados ao diagnóstico de pacientes infectados com CHIKV e MAYV. / Due the existence of 2 arthritogenic alphaviruses in Brasil, the viruses Mayaro (MAYV) and Chikungunya (CHIKV), it became important the development of efficient diagnose tests to discriminate their infections. In the present work, we developed indirect ELISAs for CHIKV and MAYV diagnosis using viral recombinant envelope proteins E2, produced in Escherichia coli, the rE2-CHIKV and rE2-MAYV. The recombinant E2 proteins had their antigenicity confirmed in the assay by using polyclonal antibodies produced in hyperimmunized mice with CHIKV, MAYV and other alphaviruses. The rE2-CHIKV ELISA detected homotypic murine antibodies and did not produced detectable cross-reactivity signal when using murine antibodies from other alphaviruses. The rE2-MAYV ELISA detected homotypic antibodies and also cross-reacted with murine anti-CHIKV antibodies, but not to other alphaviruses. These ELISAs were also tested for the detection of human antibodies, using patient sera suspected of arboviral infection. For rE2- CHIKV ELISA, it were tested 59 sera, resulting in 26 positive IgG samples. These ELISA results, when compared to those of a neutralizing assay, demonstrated a sensibility of 89.66% and specificity of 100%. The IgG positive human sera were detected in high dilutions by rE2-CHIKV ELISA. Regarding the detection of IgM, the rE2-CHIKV ELISA showed a moderate samples detection agreement when compared to other serologic assays. For rE2-MAYV ELISA, it were tested 68 sera, resulting in 23 positive IgG samples, of which 11 demonstrated to be positive by the neutralization assay, demonstrating a sensibility of 100% and specificity of 78.95%. Therefore, the rE2-CHIKV and rE2-MAYV ELISAs, especially for IgG detection, demonstrated to be properly sensitive and specific to be validated in studies using a greater number of samples, and also to be applied in the diagnosis of infected CHIKV and MAYV patients.

Devido a existência de 2 alphavírus artritogênicos no Brasil, os vírus Mayaro (MAYV) e Chikungunya (CHIKV) tornou-se importante desenvolver testes diagnósticos eficazes para discriminar suas infecções. No presente trabalho, desenvolvemos ELISAs indiretos para diagnóstico de CHIKV e MAYV utilizando proteínas de envelope viral E2 recombinantes, produzidas em Escherichia coli, as rE2-CHIKV e rE2-MAYV ELISAs. As proteínas E2 recombinantes tiveram suas antigenicidades verificadas nos ensaios utilizando anticorpos policlonais oriundos de camundongos hiperimunizados com CHIKV, MAYV e outros alphavírus. O rE2-CHIKV ELISA detectou anticorpos murinos de forma homotípica e não produziu reações cruzadas evidenciáveis utilizando anticorpos murinos específicos contra outros Alphavírus. O rE2-MAYV ELISA detectou anticorpos murinos homotípicos e também, reagiu cruzadamente com anticorpos murinos anti-CHIKV, mas não para outros Alphavírus. Esses ELISAs, também, foram usados na detecção de anticorpos em soros de pacientes com suspeita de infecção arboviral. Pelo o rE2-CHIKV ELISA, testaram-se 59 soros, resultando em 26 amostras IgG positivas. Resultados desse ELISA, quando comparados aos obtidos por teste de neutralização, demonstraram sensibilidade de 89,66% e especificidade de 100%. Soros humanos IgG positivos foram detectados em altas diluições pelo rE2-CHIKV ELISA. Quanto a detecção de IgM, o rE2- CHIKV ELISA apresentou moderada concordância com outros ensaios sorológicos. Com rE2- MAYV ELISA, testaram-se 68 soros resultando em 23 amostras IgG positivas, das quais 11 também mostraram-se positivas em teste de neutralização, demonstrando sensibilidade de 100% e especificidade de 78,95%. Portanto, os rE2-CHIKV e rE2 MAYV ELISAs, particularmente para detecção de IgG, mostraram-se adequadamente sensíveis e específicos para serem validados em estudos com maiores números de amostras e serem aplicados ao diagnóstico de pacientes infectados com CHIKV e MAYV. / Due the existence of 2 arthritogenic alphaviruses in Brasil, the viruses Mayaro (MAYV) and Chikungunya (CHIKV), it became important the development of efficient diagnose tests to discriminate their infections. In the present work, we developed indirect ELISAs for CHIKV and MAYV diagnosis using viral recombinant envelope proteins E2, produced in Escherichia coli, the rE2-CHIKV and rE2-MAYV. The recombinant E2 proteins had their antigenicity confirmed in the assay by using polyclonal antibodies produced in hyperimmunized mice with CHIKV, MAYV and other alphaviruses. The rE2-CHIKV ELISA detected homotypic murine antibodies and did not produced detectable cross-reactivity signal when using murine antibodies from other alphaviruses. The rE2-MAYV ELISA detected homotypic antibodies and also cross-reacted with murine anti-CHIKV antibodies, but not to other alphaviruses. These ELISAs were also tested for the detection of human antibodies, using patient sera suspected of arboviral infection. For rE2- CHIKV ELISA, it were tested 59 sera, resulting in 26 positive IgG samples. These ELISA results, when compared to those of a neutralizing assay, demonstrated a sensibility of 89.66% and specificity of 100%. The IgG positive human sera were detected in high dilutions by rE2-CHIKV ELISA. Regarding the detection of IgM, the rE2-CHIKV ELISA showed a moderate samples detection agreement when compared to other serologic assays. For rE2-MAYV ELISA, it were tested 68 sera, resulting in 23 positive IgG samples, of which 11 demonstrated to be positive by the neutralization assay, demonstrating a sensibility of 100% and specificity of 78.95%. Therefore, the rE2-CHIKV and rE2-MAYV ELISAs, especially for IgG detection, demonstrated to be properly sensitive and specific to be validated in studies using a greater number of samples, and also to be applied in the diagnosis of infected CHIKV and MAYV patients.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As arboviroses são doenças causadas por vírus transmitidos por vetor artrópode (artropod-born viruses). A transmissão ocorre para os hospedeiros vertebrados susceptíveis no momento do repasto sanguíneo realizado pelos artrópodes hematófagos ou pode ocorrer entre artrópodes através da via transovariana e possivelmente venérea. A região Amazônica possui um grande número de artrópodes hematófagos (culicídeos, flebotomíneos, ceratopogonídeos) e vertebrados silvestres que juntamente com o clima tropical propiciam a manutenção dos arbovírus na natureza. O manejo inadequado da natureza através do desmatamento decorrente da abertura de estradas, construção de barragens, garimpo e mineração são alguns dos eventos responsáveis por surtos de arboviroses identificados na região Norte do Brasil. O Estado de Roraima está localizado no extremo norte do país, com fronteira internacional com a Venezuela e com a Guiana e ainda com o Estado do Amazonas e Pará. Estudos regulares a respeito da circulação de arbovírus no Estado são feitos apenas para dengue e febre amarela, nos quais foi identificada a circulação dos quatro sorotipos de dengue. O grande número de casos notificados para dengue cujo diagnóstico laboratorial é negativo para este arbovírus demonstrou a necessidade de se ampliar a pesquisa para outros vírus. Foram analisadas 150 amostras cujo teste NS1 apresentou-se negativo, provenientes do Laboratório Central de Saúde Pública do Estado de Roraima, pertencentes a pacientes que manifestaram síndrome febril no período agudo da doença (até 5 dias de início dos sintomas) e que possuiam outros sintomas como: artralgia, cefaleia, dor retrorbital, calafrio, mialgia, diarreia, vômito e exantema. Conhecendo-se a maior sensibilidade da técnica de qPCR por sonda as amostras(150) foram submetidas à técnica qPCR para DENV, das quais obtivemos 33 (22%) amostras positivas para DEN tendo identificado os sorotipos por RT-PCR convencional obtendo os seguintes resultados: DENV-1(1), DENV-2(4), DENV-3(2), DENV-4(21), além de obtermos amostras negativas(3) e inconclusivas(2). Posteriormente 72 amostras que permaneceram negativas no qPCR para DENV foram submetidas a qPCR para MAYV/ORO obtendo-se positividade para MAYV(7) e para OROV(13). A identificação de outros arbovírus circulantes no Estado de Roraima torna-se necessária para que se conheça a população viral presente e assim desenvolver mecanismos de monitoramento e detecção, em tempo oportuno, da entrada de um arbovírus emergente, responsável por um possível surto. / The arboviruses are diseases caused by viruses transmitted by arthropod vector (artropod-born viruses). Transmission occurs for vertebrate hosts susceptible at the time of blood meal held by arthropod vectors or can occur between arthropods through transovarially and possibly venereal. The Amazon region has a large number of arthropod vectors (mosquitoes, sand flies, ceratopogonídeos) and wild vertebrates that coupled with the tropical climate favor the maintenance of arboviruses in nature. Inadequate management of nature through deforestation caused by the opening of roads, dams, mining and mining are some of the events responsible for outbreaks of arboviruses identified in northern Brazil. The State of Roraima is located in the extreme north of the country, with international border with Venezuela and Guyana and with the state of Amazonas and Pará. Regular studies regarding the circulation of arboviruses in the state are made just for dengue and yellow fever, which was identified in in the circulation of four dengue serotypes. The large number of reported cases of dengue laboratory diagnosis which is negative for this arbovirus demonstrated the need to expand the research to other vírus. We analyzed 150 samples with NS1 test appeared negative, from the Central Laboratory of Public Health of the State of Roraima, belonging to patients who manifested febrile syndrome in acute period of the disease (up to 5 days of onset of symptoms) and who possessed other symptoms such as arthralgia, headache, retrorbital, chills, myalgia, diarrhea, vomiting and rash. Knowing the greater sensitivity of the qPCR technique to probe the samples (150) were subjected to qPCR technique for DENV, which obtained 33 (22%) samples were positive for DEN serotypes and identified by conventional RT-PCR obtaining the following results : DENV-1 (1), DENV-2 (4), DENV-2 (3), DENV-4 (21), and obtain negative samples (3) and inconclusive (2). Subsequently 72 samples that remained negative for DENV in the qPCR were subjected to qPCR MAYV/OROV positive for obtaining MAYV (7) and OROV (13). Identification of other arboviruses circulating in the State of Roraima is necessary for knowing the viral population present and well developed mechanisms for monitoring and detection, timely entry of an emerging arbovirus responsible for a possible outbreak.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O arbovírus Mayaro (MAYV), pertence ao gênero Alphavirus, família Togaviridae e grupo sorológico A. Como parte do projeto de pesquisa sobre "Arboviroses Emergentes na Amazônia Ocidental", foi isolada uma estirpe de um alphavirus Mayaro a partir de um indivíduo febril de Acrelândia, Acre. O MAYV ocorre no ambiente silvestre ou rural em áreas próximas a florestas e seu ciclo de transmissão envolve a participação de primatas não humanos, aves e mosquito Haemagogus ssp. As características patogênicas do vírus MAY em humanos são pouco compreendidas e o potencial de dispersão desses vírus e a possibilidade de participação de espécies de mosquitos do gênero Aedes em seu ciclo de transmissão fazem desse vírus um importante organismo para estudos biológicos e epidemiológicos. Devido à natureza não específica dos sinais e sintomas de doenças febris agudas causadas por MAYV, o diagnóstico clínico é difícil e pode ser confundido com outras doenças febris, como: a febre da dengue, febre do chikungunya, febre amarela e a malária. Já o diagnóstico laboratorial por isolamento viral é laborioso e depende de infraestrutura e pessoal especializado, disponível em poucos laboratórios brasileiros. O diagnóstico imunoenzimático possui limitações quanto à utilização de partículas virais infecciosas e também por produzirem reações cruzadas com vírus da mesma família. Sendo assim, com o intuito de obter antígeno recombinante específico para detecção de MAYV, este projeto teve por objetivo expressar a glicoproteína E2 do vírus em células de insetos utilizando baculovírus recombinante como vetor. A glicoproteína E2 dos alphavirus tem a função de se ligar a receptores presentes na membrana plasmática da célula alvo para a entrada do vírus através de uma vesícula endossomal. Como resultado, foi obtido o baculovírus recombinante para a glicoproteína E2 de MAYV, e a mesma foi expressa pela primeira vez em células de inseto High-FiveTM. Apesar de utilizar vetor com sinal de exportação da proteína recombinante para o meio extracelular, a glicoproteína recombinante E2 de MAYV não foi exportada, permanecendo na fração celular da cultura. Análises da estrutura tridimensional da E2 homóloga de alphavirus indicaram que esta glicoproteína apresenta um domínio transmembrana, o que justifica sua permanência na bicamada fosfolípidica da célula hospedeira. / The arbovirus Mayaro (MAYV), belongs to the genus Alphavirus, family Togaviridae and serological group A. As part of the research project on "Emerging Arboviroses in the Western Amazon", a strain of Mayaro alphavirus was isolated from a febrile individual of Acrelândia, Acre. MAYV occurs in the wild or rural environment, in areas near to forests and its life cycle includes the participation of non-human primates, birds and mosquito Haemagogus ssp. The pathogenic characteristics of MAYV in humans are poorly understood and the dispersal potential of these viruses and the possibility of participation of species of Aedes mosquitos in its transmission cycle make this virus an important organism for biological and epidemiological studies. Because of the nonspecific nature of the signs and symptoms of acute febrile illness caused by MAYV, clinical diagnosis is difficult and can be confused with other infectious diseases, such as dengue fever, chikungunya fever, yellow fever and malaria. Moreover laboratory diagnosis by viral isolation is laborious and depends on infrastructure and trained personnel available in a few Brazilian laboratories. The enzyme immunoassay diagnosis has limitations on the use of infectious viral particles and also for producing cross-reactions with other virus from the same group. Thus, in order to obtain recombinant antigen for specific detection of MAYV, this project aimed to express the MAYV E2 glycoprotein in insect cells using recombinant baculovirus as vector. The E2 glycoprotein of the alphaviruses has the function of binding to receptors in the plasma membrane of the target cell for viral entry through an endosomal vesicle. The recombinant baculovirus was obtained for the MAYV E2 glycoprotein, and this protein was expressed for the first time in High- FiveTM insect cells. Despite using a vector with signal to exportation of the recombinant protein to the extracellular medium, the MAYV E2 glycoprotein was not exported, remaining in the cell fraction of the culture. Structural analyses of alphavirus E2 homologous protein indicated that the glycoprotein has a transmembrane domain, which justifies its permanence in the host cell phospholipid bilayer.

Background: The infection caused by Mayaro virus (MAYV), which presents as an acute febrile illness, is considered a neglected tropical disease. The virus is an endemic and emerging pathogen in South America and the Caribbean, responsible for occasional and poorly characterized outbreaks. Currently there is limited information about its expansion and risk areas. Methods: A cross-sectional study was performed in 10 urban primary care health centers in the Cajamarca region of Peru from January to June 2017. A total of 359 patients with suspected febrile illness were assessed. RNA was extracted from serum samples, following which MAYV real-time reverse transcriptase PCR (RT-PCR) for the detection of the nsP1 gene was performed. Results: MAYV was detected in 11.1% (40/359) of samples after RT-PCR amplification and confirmatory DNA sequencing. Most infections were detected in the adult population aged 18–39 years (40%) and 40–59 years (32.5%). Headache was the most frequent symptom in patients with MAYV infection (77.5%), followed by fever (72.5%), myalgia (55.0%), and arthralgia (50.0%). During the study, most of the MAYV cases were seen in May (47.5%) and April (35.0%), corresponding to the dry season (months without rain). Conclusions: This study is novel in describing the presence of MAYV in Cajamarca, an Andean region of Peru. Symptoms are non-specific and can be confused with those of other arbovirus or bacterial infections. Molecular biology methods such as RT-PCR allow the timely and accurate detection of MAYV and could thus be considered as a tool for surveillance in endemic areas. / This research was supported by the Bio & Medical Technology Development Program of the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean government (MSIT) (No. 2015M3A9B6073666 ). This study was supported by CONCYTEC Peru , under the contract No 164-2016-FONDECYT, Lima, Peru. Incentive for Research of the Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas (No. UPC-C-01-2019), Lima, Peru. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. / Revisión por pares

Recentemente, vários arbovírus têm acometido a população de países emergentes ocasionando sérios problemas de saúde pública, como as doenças causadas pelos vírus da dengue, Chikungunya, Zika e febre amarela. Um vírus emergente e já circulante no Brasil, chamado Mayaro (MAYV), do mesmo gênero do Chikungunya (Alphavirus), possui potencial prejudicial semelhante a esses já estabelecidos. Seu vetor de transmissão é o mosquito do gênero Haemagogus, característico de regiões isoladas, principalmente florestas. Entretanto, estudos demonstraram que o Aedes aegypti é um competente vetor desse agente, o que possibilita sua disseminação em regiões urbanas. O presente trabalho avaliou a expressão das proteínas estruturais do vírus Mayaro (E1, E2, E3, C e 6K), utilizando dois sistemas de expressão distintos, um baseado na levedura Pichia pastoris, e outro derivado de Baculovírus (BEVS). Essa estratégia foi estabelecida para que a expressão dessas proteínas promova a formação de partículas semelhantes ao vírus (virus like particles), estruturas multiprotéicas que mimetizam a conformação de uma partícula viral podendo ser utilizada como um candidato vacinal. O trabalho evidenciou a correta obtenção de organismos recombinantes em ambos os sistemas, com a avaliação da expressão sendo feita com técnicas de dot blot, western blot e imunofluorescência indireta (IFI). Com o sistema baculovírus, foram avaliadas as linhagens Sf-9 e Hi-5, sendo evidenciada a expressão de proteínas do MAYV em ambas, utilizando MOI 10 e tempos pós-infecção de 96 e 72 h, respectivamente. A correta expressão das proteínas de MAYV também foi evidenciada com a levedura Pichia pastoris, com cultivo a 30 °C e tempo de análise 48 h após indução. A geração de VLPs foi avaliada em amostras de sobrenadantes de ambos os sistemasapós a concentração por ultracentrifugação em gradiente de iodixanol, e análise por microscopia eletrônica de transmissão, sendo observadas nos dois sistemas com tamanhos variando entre 30-60 nm. Os resultados desse projeto podem gerar ferramentas importantes no desenvolvimento de kits diagnósticos e métodos vacinais contra o MAYV. / Recently, several arboviruses have affected emerging countries causing serious public health problems, such as diseases caused by dengue viruses, Chikungunya, Zika and yellow fever. An emerging and already circulating virus in Brazil, called Mayaro (MAYV), of the same genus of Chikungunya (Alphavirus), has harmful potential similar to those already established. Its transmission vector is the mosquito of the genus Haemagogus, characteristic of isolated regions, mainly forests. However, studies have demonstrated that Aedes aegypti is a competent vector of this agent, which would allow its dissemination in urban areas. The present work evaluated the expression of the structural proteins of the Mayaro virus (E1, E2, E3, C and 6K) using two distinct expression systems, one based on the yeast Pichia pastoris and another derived from Baculovirus (BEVS). The strategy of expressing structural proteins has been established so that the expression of these proteins promotes the formation of viruslike particles or VLPs, multiprotein structures that mimic the conformation of a viral particle and can be used as a vaccine candidate. The work evidenced the correct obtaining of recombinant organisms in both systems, with the evaluation of the expression being done with dot blot, western blot and indirect immunofluorescence (IFI) techniques. With the baculovirus system, the Sf-9 and Hi-5 strains were evaluated, and the expression of the MAYV proteins was evidenced in both, using MOI 10 and the time of post-infection analysis of 96 and 72 h, respectively. Correct expression of MAYV proteins was also evidenced with yeast Pichia pastoris, with culture at 30 ° C and analysis time 48 h after induction. The generation of VLPs was evaluated in both supernatants after concentration by iodixanol gradient ultracentrifugation and transmission electron microscopy analysis, being observed in both systems with sizes ranging from 30-60 nm. The results of this project can generate important tools in the development of diagnostic kits and vaccine methods against the MAYV.

Submitted by Valquíria Barbieri (kikibarbi@hotmail.com) on 2018-04-20T17:14:55Z No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Otacília Pereira Serra.pdf: 1299760 bytes, checksum: adf22b742c77d45b935dd95c6e46cbda (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2018-04-27T17:52:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Otacília Pereira Serra.pdf: 1299760 bytes, checksum: adf22b742c77d45b935dd95c6e46cbda (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-27T17:52:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Otacília Pereira Serra.pdf: 1299760 bytes, checksum: adf22b742c77d45b935dd95c6e46cbda (MD5) Previous issue date: 2015-04-20 / CAPES / FAPEMAT / Arbovírus são transmitidos por artrópodes hematófagos, representando um problema de saúde pública em áreas tropicais. O objetivo deste estudo foi investigar a diversidade de espécies de culicídeos e sua frequência de infecção por Alphavirus e Flavivirus em Cuiabá, MT. Foram realizadas capturas com aspirador de Nasci e puçá entre janeiro e abril de 2013 em três locais de 200 setores censitários, definidos aleatoriamente. Os culicídeos foram identificados com chave dicotômica de Forattini, alocados em pools (1-20 mosquitos) segundo sexo, espécie, data, local de coleta e armazenados a -80˚C. Pools de fêmeas foram submetidos à extração de RNA e DNA total, à multiplex semi-nested-RT-PCR para cinco alphavírus e 11 flavivírus e Nested- PCR para identificação de Culex (Cx.) quinquefasciatus. Amostras positivas para SLEV, DENV-1, -4 e MAYV foram submetidas a single RT-PCR e sequenciamento nucleotídico. Pools positivos para o MAYV foram inoculados em células Vero e submetidos a RT-PCR para o gene de envelope E1 dos alphavirus. Pools positivos para flavivirus foram inoculados em células C6/36 (Flavivirus). Calculou-se a taxa de infecção mínima (MIR). Foram capturados 11.090 mosquitos, 4.556 fêmeas de 14 espécies, perfazendo 610 pools. Foram analisados 171 pools de Aedes (Ae.) aegypti; 1 Ae. albopictus; 1 Aedes sp.; 5 Cx. bidens/interfor; 1 Cx. spinosus; 403 Cx. quinquefasciatus; 1 Galindomyia sp; 6 Limatus sp; 2 Mansonia wilsoni; 5 Psorophora (Ps.) sp; 1 Ps. ciliata; 11 Ps. varipes/albigenu; 1 Sabethes chloropterus e 1 Uranotaenia sp. Encontrou-se 1/171 (MIR=0,92) pool de Ae. aegypti positivo para DENV-1; 1/403 (MIR= 0,2) Cx. quinquefasciatus para SLEV genótipo V-A, 12/403 (MIR=3,5) de Cx. quinquefasciatus, 4/171 (MIR=3,67) de Ae. aegypti para MAYV; destes, cinco pools apresentaram co-infecção com DENV-4. Um produto de 1,3 kb obtido com o protocolo para o gene de envelope de três pools positivos para o MAYV resultou em sequências nucleotidicas inespecíficas. O MAYV foi isolado de dois pools contendo duas fêmeas não ingurgitadas de Ae. aegypti (#958) e duas de Cx. quinquefasciatus (#489). Positividade para DENV-4 foi identificada em 58/171 (MIR=53,35) Ae. aegytpi, 105/403 (MIR=30,65) Cx. quinquefasciatus, 2/5 (MIR=400) Psorophora sp, 2/11 (MIR=142,85) Ps. varipes/albigenu, 1/1 (MIR= 1000) Sabethes chloropterus, 2/5 (MIR=285.7) Cx. bidens/interfor e 1/1 (MIR=1000) Aedes sp. O DENV-4 foi isolado de dois pools contendo três (#329) e 16 (#806) fêmeas de Cx. quinquefasciatus não ingurgitadas. O SLEV, MAYV e os sorotipos do DENV foram identificados em pacientes com suspeita de dengue na cidade de Cuiabá em estudos prévios do Laboratório de Virologia. Experimentalmente, Culex e Aedes spp. são vetores competentes do MAYV. A identificação do vírus em fêmeas não ingurgitadas sugere que estas espécies podem estar envolvidas no ciclo urbano do MAYV em Cuiabá. Dentre os sorotipos do DENV, somente o DENV-1 e o DENV-4 foram identificados em culicídeos. O DENV-4 tem produzido importantes epidemias em MT desde 2012. A positividade para DENV-4 em diferentes espécies de culicídeos pode ser decorrente de infecção natural ou da hematofagia em humanos, pois muitos destes pools apresentavam fêmeas ingurgitadas. Cuiabá possui ecossistema favorável para a ocorrência de arboviroses e proliferação de vetores. Estudos envolvendo vigilância entomológica e virológica são importantes para estimar a situação epidemiológica dos arbovírus no estado. / Arbovirus are transmitted by hematophagous arthropods, posing a public health issue in tropical areas. The aim of this study was to investigate the diversity of culicidae and their frequency of infection by arboviruses from Alphavirus and Flavivirus genus in Cuiabá, MT. To achieve that, culicids were captured with Nasci aspirators and hand net between January and April 2013 in three locations of 200 censitary sectors randomly defined. The specimens were identified using the Forattini dichotomy key, allocated in pools (1-20 mosquitoes), according to sex, species, day and place of capture, and stored at -80˚C. Female pools were subjected to total RNA and DNA extraction and to multiplex semi-nested-RT-PCR for five alphaviruses and 11 flaviviruses and Nested-PCR for Culex (Cx.) quinquefasciatus identification. The pools positive for SLEV, DENV-1, -4 and MAYV were subjected to single RT-PCR and nucleotide sequencing. MAYVpositive pools were inoculated in Vero cells and subjected to RT-PCR for the E1 envelope gene of alphaviruses. Pools positive for flaviviruses were inoculated in C6/36 cells. The minimum infection rate (MIR) was calculated. 11,090 mosquitoes were captured, 4,556 females belonging to 14 species, comprising 610 pools, 171 pools of Aedes (Ae.) aegypti specimens; 1 Ae. albopictus; 1 Aedes sp.; 5 Cx. bidens/interfor; 1 Cx. spinosus; 403 Cx. quinquefasciatus; 1 Galindomyia sp.; 6 Limatus sp.; 2 Mansonia wilsoni; 5 Psorophora sp.; 1 Ps. ciliata; 11 Ps. varipes/albigenu; 1 Sabethes chloropterus e 1 Uranotaenia sp. Among them, 1/171 (MIR=0.92) Ae. aegypti pool was positive for DENV-1 and 1/403 (MIR=0.3) Cx. quinquefasciatus for SLEV genotype V-A. For MAYV, 12/403 (MIR=3.5) Cx. quinquefasciatus, 4/171 (MIR=3.67) Ae. aegypti were positive, five of them were also infected by DENV-4. A DNA product with 1.3 kb obtained from three pools positive for MAYV with the protocol for the envelope gene resulted in unspecific nucleotide sequences. MAYV was isolated from two pools, both containing two non-engorged females of Ae. aegypti (#958) and Cx. quinquefasciatus (#489). DENV-4 was detected in 58/171 (MIR=53.35) Ae. aegytpi, 105/403 (MIR=30,65) Cx. quinquefasciatus, 2/5 (MIR=400) Psorophora sp., 2/11 (MIR=142.85) Ps. varipes/albigenu, 1/1 (MIR= 1000) Sabethes chloropterus, 2/5 (MIR=285.7) Cx. bidens/interfor and 1/1 (MIR=1000) Aedes sp. DENV-4 was isolated from two pools containing three (#329) and 16 (#806) non-engorged females of Cx. quinquefasciatus. The SLEV, MAYV and the four DENV serotypes were identified in patients suspected of harboring dengue infection in Cuiabá in previous studies of the Virology Laboratory. Experimentally, Culex and Aedes spp. are competent vectors for MAYV. The identification of the virus in nonengorged females suggests these species may be involved in the urban cycle of MAYV in Cuiabá. Among the DENV serotypes, only DENV-1 and DENV-4 were identified in culicids captured in the city. DENV-4 has been responsible for major outbreaks in MT since 2012. The identification of DENV-4 in several mosquito species might be resultant either from natural infection or hematophagy in humans, since several of these pools presented engorged females. Cuiabá presents a favorable ecosystem for the occurrence of arboviruses and vector proliferation. Studies involving entomological and virological surveillance are important to estimate the epidemiological situation of arboviruses in the state.