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Rotavirus is the leading cause of severe infantile diarrhea worldwide. Most related deaths occur in infants from developing countries. Current vaccines are expensive and not readily available throughout the world. Chloroplast transformation technology can be utilized to generate genetically modified plants that produce large quantities of therapeutic proteins and vaccine antigens within their leaves. Plants that are used as bioreactors for vaccine antigens are economically advantageous because they eliminate the need for purification steps and are cheaper to transport. A genetically modified crop could potentially be grown near an endemic area and harvested as needed. There are many influencing factors for transgene expression levels within plant leaves that must be taken into account prior to their harvest. In this work, we seek to determine the optimal expression of CTB-NSP4 in two different cultivars of tobacco plant that have been previously generated by the Daniell lab. The fusion protein, CTBNSP4, is hoped to confer resistance to both rotavirus and cholera. We will determine how the expression of the protein is affected by different variables such as the lighting conditions during harvest and the relative age of leaf at the time of harvest. This knowledge can be used to raise the productivity of the genetically modified plants, further decreasing the cost. Additionally, as unprocessed leaf cannot be used directly for oral delivery due to an unknown concentration of the vaccine antigen, quantification is an important barrier to overcome. Low cost vaccines can be prepared after optimization of dosage and stability. This project seeks to substantiate and quantify genetically modified tobacco plants producing the rotavirus and cholera vaccine antigens.

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L'objectif général de cette thèse était d'étudier le rôle des anticorps dans la susceptibilité ou la résistance au paludisme chez de jeunes enfants béninois exposés naturellement aux infections palustres durant leurs deux premières années de vie. Deux projets complémentaires (PALNOUGENENV et TOLIMMUNPAL) ont été mises en place au Bénin et consistaient à suivre des mères et leurs enfants. Dans le cadre du projet PALNOUGENENV, l'étude incluait 600 mères à l'accouchement et a suivi leurs enfants pendant les dix-huit premiers mois de vie dans le but d’étudier les conséquences de l’infection placentaire palustre chez les mères sur la survenue des premières infections palustres chez les nouveau-nés. Suite au projet PALNOUGENENV, il semblait important de connaitre le statut palustre de la mère pendant la grossesse et pas seulement à l’accouchement. Le projet TOLIMMUNPAL a donc été mis en place et incluait 400 mères et leurs enfants. Les mères ont été inclues à la première consultation prénatale et suivies au niveau parasitologique et clinique jusqu'à l'accouchement et leurs enfants ont été suivis de la naissance jusqu'à 24 mois dans le but d'étudier des déterminants environnementaux, biologiques et génétiques impliqués dans le développement de la tolérance immunitaire associée au paludisme et ses conséquences sur la protection de la femme enceinte et du jeune enfant. Plus spécifiquement, nous avons étudié chez ces enfants les relations entre l'infection palustre et les niveaux d'anticorps spécifiquement dirigés contre les antigènes candidats vaccins les plus avancés du stade érythrocytaire d'une part et la capacité des anticorps à inhiber le développement in vitro de P. falciparum d'autre part. Nos résultats mettent en évidence une association dans la cohorte PALNOUGENENV entre les niveaux élevés des sous-classes cytophiles IgG1 dirigées contre les antigènes candidats vaccins MSP1 (p<0,001, OR=0,90) et IgG3 anti-MSP2 (p<0,001, OR=0,89) et la protection contre l'infection palustre. Dans la cohorte TOLIMMUNPAL, les hauts niveaux d'IgG2 anti-GLURP R2 (p=0.05, OR=2.10) ont plutôt été associés au risque d'infection palustre. L'analyse fonctionnelle des IgG en utilisant le test GIA a révélé que l'infection par P. falciparum au moment du prélèvement affectait la capacité des IgG à inhiber la croissance parasitaire in vitro. Les IgG purifiées à partir d'échantillons collectés chez des individus infectés par P. falciparum avaient une capacité moyenne d'inhibition de la croissance parasitaire inférieure (p=0.003, Wilcoxon matched pairs test) de 19 % à celles purifiées à partir de plasmas d'enfants non infectés. Une corrélation inverse a été observée entre l'âge et la capacité des anticorps à inhiber l'invasion des globules rouges par le parasite. Aucune association entre les niveaux d'anticorps et leur capacité à inhiber le développement du parasite in vitro n'a été mis en évidence. Dans le cadre du développement du test Antibody-Dependent Respiratory Burst (ADRB), les cellules promyélocytaires de la lignée PLB 985W ont été utilisées. Ces cellules ont la capacité de se différencier en neutrophiles sous l'action du DMSO. Nos résultats ont montré que cette lignée a une faible capacité à produire les espèces réactives d'oxygène (ROS) comparés aux neutrophiles humains et les niveaux de ROS produits par cette lignée cellulaire sont insuffisants pour être utilisés dans le test ADRB. Nos résultats confortent le rôle important des antigènes candidats vaccins MSP1 et MSP2 dans la protection contre le paludisme. Cette relation est essentiellement établie au regard des quantités d’anticorps spécifiques produits, l’étude de fonctionnalité des anticorps employant le test GIA n’ayant pas permis de mettre en évidence de relation claire à la protection. (...) / The aim of this thesis was to study the role of antibodies in susceptibility or resistance to malaria in young Beninese children naturally exposed to malaria infections during their first two years of life. Two complementary projects (PALNOUGENENV and TOLIMMUNPAL) were implemented in Benin to identify individual factors of malaria susceptibility. The PALNOUGENENV cohort included 600 mothers at delivery and their children from birth to 18 months of age in order to study the effects of placental malaria infection in mothers on first occurrence of malaria infections in newborns. In the TOLIMMUNPAL cohort 400 mothers were included at the first antenatal visit and followed until delivery while their infants were followed from birth to 24 months in order to study environmental determinants, biological and genetic involved in the development of immune tolerance associated with malaria and its impact on the protection of pregnant women and infants. Specifically, the association between malaria infection and the level of antibodies specifically directed against the most advanced vaccine candidate antigens of the erythrocyte stage on one hand and the ability of antibodies to inhibit in vitro the development of P. falciparum on the other hand were investigated. Our results show an association in the cohort PALNOUGENENV between high levels of IgG1 to MSP1 19 vaccine candidate antigens (p <0.001, OR = 0.90) and IgG3 to MSP2 3D7 (p <0.001, OR = 0.89) and protection against malaria infection. In the TOLIMMUNPAL cohort, high levels of IgG2 to GLURP R2 (p = 0.05, OR = 2.10) were instead associated with an increased risk of malaria infection. Functional analysis of IgG using the GIA test revealed that the infection with P. falciparum at the sampling time affected the ability of IgG to inhibit parasite growth in vitro. The purified IgG from individuals infected with P. falciparum when the sample was collected had an average 19% lower capacity of inhibition of parasite growth (p = 0.003, Wilcoxon matched pairs test) than those that were uninfected at the time of sampling. An inverse correlation was found between age and the ability of antibodies to inhibit in vitro invasion of red blood cells by the parasite. There was no association between antibody levels and ability to inhibit the in vitro parasite development. In the development of the Antibody-Dependent Respiratory Burst (ADRB) assay, the promyelocytic cell line PLB 985W was used. These cells have the capacity to differentiate into neutrophils after exposure to DMSO. Our results showed a low ability of this cell line to produce reactive oxygen species (ROS) compared to human neutrophils and ROS levels produced by this cell line are insufficient to be used in the test ADRB. Our results confirm the important role of MSP1 19 and MSP2 3D7 vaccine candidate antigens in malaria protection. Although the levels of antibodies to MSP1 19 and MSP2 3D7 were associated with decrease risk of P. falciparum infection, the functional study of antibody using the GIA assay did not allow demonstrating the relationship to protection. Investigation on the functional role of antibodies is complex as IgG could act through multiple direct or indirect mechanisms. We will continue to investigate the functional role of antibody, particularly in plasma samples from our two birth cohorts by using the ADRB assay. Results will aid in providing new information to the existing knowledge gap and will help in malaria vaccine development.