O milho (Zea mays subsp. mays) foi domesticado a cerca de 8000 anos, a partir do teosinto. A variação genética das populações domesticadas de milho pode ter sido reduzida pela deriva e pela seleção, promovida pelos primeiros agricultores. Diversos trabalhos indicam que o genoma do milho cultivado apresenta uma perda de variabilidade quando comparado ao seu ancestral silvestre. É nesta variabilidade, pertencente ao teosinto, que se podem identificar alelos de interesse agronômico para a cultura do milho, tais como os relacionados com tolerância a estresses bióticos e abióticos. Apesar da proximidade existente entre milho e teosinto, poucos trabalhos caracterizam este táxon. Os objetivos deste estudo foram analisar a variabilidade genética de duas populações de teosinto (Zea mays subsp. mexicana), a partir de análises fenotípicas, bioquímicas e moleculares e avaliar a compatibilidade dos cruzamentos dirigidos entre milho e teosinto, a partir da viabilidade dos grãos de pólen e da obtenção de populações segregantes. Os genótipos foram analisados através de oito caracteres fenotípicos, 12 bandas isoenzimáticas e 25 locos microssatélites. Os dados morfológicos demonstraram elevada diversidade genética entre as populações de teosinto (0,84), concordando com a similaridade média obtida pelos dados de esterase (0,24). Entre os 25 locos microssatélites analisados, 88% apresentaram polimorfismo, com uma média de 2,5 alelos por loco e divergência genética reduzida entre as populações (0,14). A estrutura genética das populações foi considerada moderadamente alta, com um coeficiente de endogamia de 0,44. Também foi observado moderado grau de diferenciação genética (0,15) e reduzido fluxo gênico entre as populações de teosinto. Foi observada uma elevada freqüência de grãos de pólen viáveis (acima de 90%), sugerindo ausência de barreiras citológicas entre milho e teosinto. Os cruzamentos indicaram incompatibilidade entre as duas subespécies e presença de barreiras genéticas. Este trabalho representa uma contribuição para a caracterização da variabilidade genética em teosinto e indica o potencial deste germoplasma silvestre como recurso genético para o melhoramento de milho. / Maize (Zea mays subsp. mays) was domesticated about 8000 years ago, from teosinte. Genetic variability of domesticated maize populations may have been reduced due to genetic drift and early farmer’s selection. There is scientific indication that the cultivated maize genome presents a loss of variability when compared with its wild ancestral. The variability present in teosinte germplasm, which was not selected during domestication, can be used to identify alleles for important agronomic traits for maize, such as related with biotic and abiotic stress tolerance. Although teosinte is closely related to maize, there are few works on characterization of this subspecies. The objectives of this study were to analyze the genetic variability of two populations of teosinte (Zea mays subsp. mexicana), through phenotypic, biochemic and molecular analysis, and to evaluate the compatibility of oriented crosses between maize and teosinte from segregant populations and of pollen grains viability. The genotypes were analyzed through eight phenotypic traits, 12 isozymes bands and 25 microsatellites loci. The phenotypic data indicated high genetic variability (0.84) between the teosinte populations, agreeing with the average similarity (0.24) of esterases data. Amongst 25 analyzed SSR loci, 88 % presented polymorphism, with an average of 2.5 alleles/locus, and reduced genetic distance between the populations (0.14). The genetic structure of the populations was considered to be moderately high, presenting a coefficient of endogamy of 0.44. Also was observed moderate genetic differentiation (0.15) and reduced gene flow between the populations. It was observed a high frequency of viable pollen grains (above of 90%), suggesting absence of cytological barriers between maize and teosinte. The crossings had indicated incompatibility between the two subspecies and presence of genetic barriers. This work represents a contribution for the characterization of the genetic variability in teosinte and indicates the potential of this wild germplasm as genetic resource for maize breeding.

Resumo não disponível

A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é uma condição lentamente progressiva de pobre reversibilidade que se caracteriza pela limitação do fluxo aéreo associada a uma resposta inflamatória anormal dos pulmões. Seu desenvolvimento e progressão estão relacionados ao incremento do estresse oxidativo, sendo este um importante componente patogênico da inflamação das vias aéreas nesta doença. Sendo assim, este estudo caso-controle teve por objetivo avaliar e quantificar danos no DNA (pelo do ensaio cometa alcalino simples e modificado com as endonucleases Fpg e Endo III e pelo teste de micronúcleos de esfoliado da mucosa oral) em lipídios (pelo ensaio de TBARS) e proteínas (pelo ensaio com DNPH), bem como avaliar a influência dos polimorfismos de genes envolvidos na Fase I do metabolismo de xenobióticos (CYP1A1 C2453A e CYP2E1 C-1053T), Fase II (GSTM1null, GSTT1null e GSTP1 Ile105Val), e na neutralização de espécies reativas de oxigênio (CAT C-262T e GPx1 Pro198Leu) sobre os biomarcadores. A população estudada compreendeu 51 indivíduos de função pulmonar saudável e 51 pacientes com DPOC da região do Vale do Rio Pardo, RS, Brasil. Os pacientes apresentaram índices de dano superiores no cometa alcalino e modificado com Fpg e Endo III (P<0,001; P=0,023 e P=0,021, respectivamente). Não houve diferença na formação de MN entre os grupos (P=0,651). Os pacientes que não participavam de um programa de reabilitação pulmonar apresentaram índices de peroxidação lipídica superiores aos controles e àqueles que participavam dos exercícios (P<0,001). Adicionalmente, foi encontrada uma tendência a uma maior carbonilação proteica nos pacientes não aderentes ao programa. Todos os polimorfismos investigados apresentaram diferentes efeitos modulatórios nos índices de dano do ensaio cometa, nos controles, pacientes, ou ambos, mas não na formação de micronúcleos. Além de ressaltar os efeitos da inflamação sistêmica típica da DPOC, esse estudo evidencia a influência da variabilidade genética individual sobre o dano não clastogênico no DNA destes pacientes. / Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a slowly progressive condition of poor reversibility that is characterized by airflow limitation associated with an abnormal inflammatory response of the lungs. Its development and progression are related to increased oxidative stress, which is an important pathogenic component of airway inflammation in this disease. Thus, this case-control study, aimed to evaluate and quantify DNA (using the alkaline and endonuclease-modified comet assay and micronucleus test in exfoliated oral mucosal ), lipid (TBARS) and protein (DNPH assay) damage, and to evaluate the influence of genetic polymorphisms of genes involved in Phase I metabolism of xenobiotics (CYP1A1 C2453A, CYP2E1 C-1053T), Phase II (GSTM1null, GSTT1null, GSTP1 Ile105Val), and neutralization of ROS (CAT C-262T and GPx1 Pro198Leu) on these biomarkers. The target population comprised 51 individuals with healthy pulmonary function and 51 patients with COPD from the Rio Pardo Valley, RS, Brazil. The patients had higher Damage Index (DI) in the alkaline, Fpg and Endo III-modified comet, (P <0.001, P = 0.023 and P = 0.021, respectively). There was no difference in the formation of MN between the groups (P = 0.651). Patients who had not participated in a pulmonary rehabilitation program showed higher levels of lipid peroxidation than the controls and those who participated in the exercises (P <0.001). Additionally, it was found a trend towards a higher protein carbonylation in these non-adherent patients. All investigated polymorphisms had distinct modulatory effects in the comet assay’s DI in controls, patients, or both, but not in the micronucleus formation. Aside from highlighting the effects of the COPD’s typical systemic inflammation, this study stresses the influence of individual genetic variability on non-clastogenic damage in these patients’ DNA.

O grupo willistoni de Drosophila é o grupo de espécies mais bem representado nas comunidades neotropicais de insetos da família Drosophilidae. Ele é constituído por 6 espécies crípticas e por 19 não crípticas e a este grupo de espécies é atribuída origem no Brasil Central, em associação com habitats de florestas quentes e úmidas. Drosophila willistoni, tida como a remanescente do ancestral comum, chama particularmente a atenção dentro do grupo, por possuir uma grande "versatilidade ecológica" diversas vezes comprovada, o que se expressa pela capacidade de exploração bem sucedida de diversos tipos de ambientes, tais como matas, formações abertas, cidades, bem como de diferentes tipos de substratos alimentares e de criação. Sua distribuição geográfica vai desde o sul dos Estados Unidos (Flórida) e México na América do Norte, até o norte da Argentina na América do Sul. Além desta versatilidade ecológica, e talvez subjacente a ela, D. willistoni apresenta uma grande variabilidade genética expressa através de diferentes marcadores genéticos já estudados, tais como polimorfismo cromossômico para inversões paracêntricas e polimorfismo enzimático. Tendo em vista este panorama, o presente trabalho teve como objetivo amplo fazer uma busca no genoma de D. willistoni, no sentido de encontrar alguma indicação para explicar esta variabilidade genética e versatilidade ecológica em nível de DNA repetitivo. A primeira tentativa que realizamos de isolar e caracterizar este tipo de DNA em D. willistoni está descrita no capítulo 4, onde verificamos que as seqüências que compõe os telômeros desta espécie são muito divergentes do modelo D. melanogaster. Partimos, então, para o passo seguinte da investigação descrito no capítulo 2, que seria isolar seqüências repetitivas do genoma de D. willistoni. Nossos resultados iniciais demonstraram a existência de um padrão sexoespecífico na clivagem do DNA genômico de machos e fêmas com as enzimas de restrição AluI e HaeIII. À medida que foi sendo investigado este padrão, levounos à descrição de um fenômeno biológico tido como inexistente no genoma de D. melanogaster: a metilação. Isolamos e seqüenciamos parcialmente 44 clones que consideramos ser segmentos do genoma de D. willistoni que estão envolvidos neste processo de metilação, sendo que identificamos entre estas o gene ribossomal 18S. No capítulo 3 aprofundamos estas investigações referentes à metilação e concluímos que no genoma de D. willistoni ocorrem compartimentos metilados, tais como ocorre em Molusca, Cnidários e outros animais e um destes compartimentos corresponde à uma parte dos genes ribossomais. A partir destes resultados nosso trabalho propõe uma mudança num conceito estabelecido no Gênero Drosophila sobre metilação. Nós estamos demonstrando que este mecanismo epigenético de controle da expressão gênica existe no genoma de D. willitoni e que, portanto, ela estaria fazendo parte do grupo de organismos que tem o seu DNA fracionalmente metilado. / The Drosophila willistoni species group is the most abundant in Neotropical assemblies. It is native from Central Brazil and is constituted by 6 sibling and 19 non-sibling species, living in association with hot and humid forests. In this group, Drosophila willistoni call special attention because it have a recognized great “ecological versatility”, expressed by the ability to explore several types of environments, as forests, open formations, cities and to breed in several types of substrates. Its geographical distribution comprehends since Florida, in the South of United States of America and Mexico, until the North of Argentina, in South America. Besides this ecological versatility, D. willistoni also presents an ample genetic variability detected by several genetic markers, exemplified by the chromosomal polymorphism for paracentric inversions and the enzymatic polymorphism. Considering this scenario, the present study have the main objective to make a molecular screening in the genome of D. willistoni, trying to found some clue that could explain such genetic and ecological variability at the level of repetitive DNA. The results of our first attempt to isolate and to characterize this type of DNA in D. willistoni are described in Chapter 4, where we verify that the telomeric sequences of this species are very divergent of those occurring in the modelspecies D. melanogaster. The next step of our investigation was to isolate repetitive sequences of the D. willistoni’s genome. This attempt is described in Chapter 2 and our results showed sex-specific patterns of cleavage of genomic DNA of males and females with the restriction enzymes AluI e HaeIII. These results demonstrated by the first time, the existence of a phenomenon not found in D. melanogaster: the metylation in the genome of D. willistoni. Isolating and partially sequencing 44 clones considered by us as segments of the genome of D willistoni involved in the mechanism of methylation, we found the 18S ribosomal gene among them. In Chapter 3, we continued the investigations about methylation in the genome of D. willistoni and concluded that in this species, as occurs in the genomes of other animals, as Mollusca and Cnidaria, exists methylated compartments, and that one of these compartments, correspond to part of the ribosomal genes. Considering all our findings, we propose a change in the previously established concept about lack of methylation in the Genus Drosophila. We demonstrated that this epigenetic mechanism of control of gene expression exists in the genome of D. willistoni, and so, this species needs to be considered as member of the group of organisms which have its DNA fractionally methylated.

O capim-limão é uma planta herbácea, perene, que ocorre naturalmente no estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Seu potencial econômico se deve ao fato de apresentar óleo essencial utilizado como aromatizante e flavorizante, além de apresentar atividade bactericida atribuída tanto ao óleo quanto ao conteúdo de compostos fenólicos. Apesar da importância, poucos estudos foram desenvolvidos para esta espécie. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar populações nativas de Elionurus sp., estimando a variabilidade existente e contribuindo com novas informações para subsidiar programas de exploração e melhoramento dessa espécie. O trabalho foi realizado com cinco populações de capim-limão coletadas no Rio Grande do Sul, totalizando 50 plantas cultivadas em vasos na Faculdade de Agronomia. Os compostos fenólicos foram quantificados através do método Folin- Ciocaultreau, utilizando-se o ácido gálico como padrão. O óleo foi caracterizado quimicamente por cromatografia gasosa e espectrometria de massas. O marcador molecular utilizado para a análise da variabilidade genética foi o RAPD. As cinco populações de capim-limão apresentaram variabilidade para aos caracteres fenotípicos e para concentração de compostos fenólicos. O óleo essencial apresentou variabilidade de compostos, sendo o Geranial e o Neral os mais importantes. A análise molecular demonstrou uma elevada variabilidade para as populações, permitindo a separação dos indivíduos em cinco grupos, sendo possível, de modo geral, agrupá-los de acordo com a origem geográfica. Observou-se também que a maior variabilidade ocorre dentro de cada população. Os resultados indicaram que a população São Francisco de Paula foi a de pior desempenho para a maioria dos caracteres avaliados. As populações São Borja e Faculdade de Agronomia foram as que apresentaram maior destaque em relação às demais, exibindo elevado conteúdo de Citral e melhor desempenho nos caracteres observados, podendo ser recomendadas para utilização em programa de melhoramento. / Lemon-grass is a herbaceous, perennial plant, that occurs in Rio Grande do Sul (Brazil). It has economic potential due to the presence of essential oils, which are used in perfume and flavor industry. In addition, this species present recognized bactericidal activity attributed to the essential oils and phenolic compounds. Despite of this, few studies have been developed for this species. The present work aimed to analyze native populations of Elionurus sp., contributing with new information to subsidize farm exploration and breeding programs. The analysis was preformed with five populations of lemon grass collected in different location of Rio Grande do Sul, totalizing 50 plants cultivated in pots in the Faculdade de Agronomia/UFRGS. The phenolic compounds were quantified through the Folin-Ciocaultreau method, using Gallic acid as a standard. The essential oils were characterized chemically by gas chromatography and mass spectrometry. RAPD was used as molecular marker for the analysis of genetic variability. The five populations of lemon grass presented variability for the phenotypic traits and phenolic compounds concentration. The essential oils also presented variability, being Geranial and Neral the most important. Molecular analysis demonstrated high variability for the populations, allowing the separation in five groups. It was possible to match molecular grouping with geographic origin. On the other hand, the largest variability was observed within populations. The results indicated that São Francisco de Paula population had the worst performance for the majority of the evaluated traits. The populations São Borja and Faculdade de Agronomia presented high production of Citral and they also showed the best performance for the observed traits. As a consequence, it is possible to recommend both populations as starting germplasm for breeding programs of lemon-grass.

Os híbridos são os principais materiais de milho cultivados no mundo e a oportunidade de introduzir variabilidade genética nesses materiais é muito limitada, devido às altas exigências do mercado em relação à produtividade. Por essa razão, os melhoristas, em geral, utilizam o próprio germoplasma elite como fonte de variabilidade, garantindo, dessa forma, a manutenção do padrão dos seus materiais. Entretanto, muitas vezes a variabilidade desses genótipos é insuficiente, tornando necessária a busca de alelos em materiais de locais distantes, que muitas vezes apresentam problemas de adaptação ambiental. As variedades crioulas, em contrapartida, além de serem ricas em variabilidade genética, são naturalmente adaptadas às regiões de origem. A desvantagem desses materiais é que eles são agronomicamente inferiores, limitando o seu uso direto como variedade comercial ou como fonte de germoplasma. Por essa razão, um dos grandes desafios do melhoramento genético tem sido determinar estratégias que permitam a rápida e eficiente incorporação de variabilidade em materiais elite. Em milho, os principais caracteres agronômicos têm natureza quantitativa. Dessa forma, a identificação de QTLs (Quantitative Trait Loci) e a introgressão de alelos superiores, a partir de gerações avançadas de retrocruzamentos (AB-QTL, Advanced Backcrosses- QTL) entre linhagens elite e variedades crioulas, poderia ser uma estratégia para a incorporação de variabilidade. Sendo assim, os objetivos desse trabalho foram selecionar variedades crioulas com caracteres agronômicos de interesse e linhagens elite, identificar QTLs associados a caracteres agronômicos e verificar o potencial da técnica de AB-QTL para a introgressão de alelos superiores da variedade crioula na linhagem elite. Após o cruzamento entre a linhagem elite LA67 e a variedade crioula Argentino Flint, foram realizados dois retrocruzamentos com a linhagem e dois ciclos de autofecundação. A progênie resultante foi genotipada com microssatélites e fenotipada para 25 caracteres agronômicos. Foram identificados 29 QTLs e pelo menos cinco alelos superiores da variedade crioula foram introgredidos na linhagem elite. Esses resultados indicaram que a técnica de AB-QTL foi eficiente tanto para a identificação de novos QTLs quanto para a introgressão de alelos superiores da variedade crioula na linhagem elite. / Most corn presently cultivated in the world are hybrids. The chances to introduce genetic variability in this material are small due to market requirements in terms of productivity. For this reason corn breeders in general use their own elite germoplasm as source of genetic variability, maintaining therefore the standard characteristics of their germoplasm. However, the variability of these genotypes might be insufficient, requiring the use of germoplasm from different locations that often do not have wide environment adaptation. The landraces, besides being rich in genetic variability, are naturally adapted to their sites of origin. The disadvantage of these materials is that they are agronomically inferior, limiting their direct use as commercial varieties or as germplasm source. For this reason one of the main challenges of genetic breeding has been to create strategies that allow a rapid and efficient incorporation of variability in elite materials. In corn the main agronomic characters are of quantitative nature. Therefore the QTLs (Quantitative Trait Loci) identification and the introgression of superior alleles from advanced generations of backcrosses (AB-QTL, Advanced Backcrosses QTL) between elite lines and landraces, could be a strategy to incorporate variability. The objectives of this work were: to select landraces with agronomic traits and elite lines, to identify QTLs associated with agronomic characters in corn, and to verify the potential of the AB-QTL technique for introgression of superior alleles from the landraces into elite lines. Two backcrosses and two self-fertilization cycles were done after crossing the elite line LA67 with the Argentino Flint landrace. The progeny was genotyped with microssatelites and phenotyped for 25 agronomic traits. Twenty nine QTLs were identified and at least five superior alleles of the landrace were introgressed into the elite line. The results indicated that the AB-QTL technique was efficient for the identification of new QTLs and for the introgression of superior alleles in the elite lines.

O gênero Petunia Juss. (Solanaceae) é conhecido mundialmente através do híbrido artificial Petunia hybrida e as duas espécies parentais, P. integrifolia e P. axillaris, são nativas do Sul da América do Sul. Porém, P. integrifolia é formada por um complexo de espécies semelhantes na estrutura floral, mas diferentes no habitat e distribuição. O objetivo deste trabalho é contribuir para um melhor detalhamento da origem da espécie comercial P. hybrida e determinar a variabilidade genética nas espécies e subespécies do grupo integrifolia. Neste trabalho foram utilizadas 13 populações naturais distribuídas entre os cinco taxa que compõem o complexo: Petunia bajeensis, Petunia inflata, Petunia integrifolia subsp. integrifolia, Petunia integrifolia subsp. depauperata e Petunia interior. Além disso, foram incluídas 22 variedades de P. hybrida abrangendo as duas principais classificações comerciais: Grandiflora e Multiflora. Dez marcadores de microssatélites desenvolvidos para Petunia integrifolia subsp. depauperata foram transferidos para as outras espécies do grupo integrifolia. Padrões de diversidade genética e estruturação populacional foram estudados utilizando sete destes loci de microssatélites. Dados de sequência de marcadores plastidiais foram adicionados para permitir uma comparação entre as espécies do gênero Petunia e as variedades comerciais através de uma rede de haplótipos. A probabilidade de ancestralidade foi inferida entre as populações estudadas e as variedades de P. hybrida. A análise da AMOVA mostrou que 66% da variação genética estão entre os indivíduos amostrados. A espécie P. bajeensis apresentou baixa variabilidade comparada com as outras do complexo integrifolia e se mostrou geneticamente muito distinta do restante do grupo. Foi detectado um relacionamento genético muito próximo entre as espécies P. inflata e P. interior, bem como para as subespécies de P. integrifolia. Dados de cpDNA revelaram um compartilhamento de haplótipos entre variedades comerciais e as espécies P. integrifolia subsp. integrifolia, P. axillaris e P. altiplana. Os resultados obtidos permitiram excluir as espécies P. bajeensis e P. integrifolia subsp. depauperata como possíveis parentais de flor roxa da petúnia-dejardim e apontar para populações de P. inflata e P. interior localizadas na região noroeste do Rio Grande do Sul e arredores. Este foi o primeiro estudo realizado com a utilização de marcadores microssatélites em populações naturais de Petunia e forneceu novas ferramentas moleculares para estudos futuros. / The results allowed to exclude P. bajeensis e P. integrifolia subsp. depauperata as possible purple-flowered parents of garden petunias, pointing P. inflata e P. interior populations, located in northwestern Rio Grande do Sul and surrounding regions, as possible parents. This was the first study that used microsatellite markers in natural Petunia populations, and provided new molecular tools for future investigations.

Resumo não disponível

O gênero Calydorea pertence à família Iridaceae, com aproximadamente 16 espécies, ocorrendo exclusivamente na América do Sul. Dentre essas, Calydorea crocoides Ravenna destaca-se por ser uma espécie bulbosa, perene, com distribuição predominante no Sul do Brasil, na Região dos Campos de Cima da Serra no Rio Grande do Sul. Esta região contém um número elevado de plantas endêmicas, sendo particularmente importante para estudos relativos à conservação e a padrões de diversificação em um ambiente subtropical de transição. Os Campos de Cima da Serra correspondem a uma região bastante antropizada por práticas agrícola e extrativista, o que sem dúvida fornece um laboratório natural para o estudo da origem e conservação da biodiversidade. O presente estudo objetivou investigar a variabilidade genética e caracterizar com ferramentas citogenéticas a espécie Calydorea crocoides ocorrente na Região Sul do Brasil. Os resultados da análise da variabilidade genética utilizando sete marcadores Inter Sequências Simples Repetidas (ISSR) para 235 indivíduos pertencentes a oito populações de C. crocoides amostradas nos estados do RS e SC mostrou que a diversidade genética detectada ao nível populacional foi baixa, no entanto ao nível de espécie foi relativamente alta evidenciando uma moderada estruturação populacional. Espécies com faixa de distribuição geográfica limitada tendem a manter menores níveis de variação genética do que espécies com distribuição geográfica ampla. Diversidade genética alta é esperada ser encontrada em uma espécie que tem vida longa, uma alta frequência de fluxo gênico e dispersão de sementes. Espécies com baixo fluxo gênico, resultado observado em C. crocoides, tendem a apresentar maior diferenciação genética do que espécies com alto fluxo gênico refletindo um certo grau de isolamento espacial, embora não tenha havido correlação entre distância geográfica e distância genética. Provavelmente o nível atual de diversidade genética seja apenas um reflexo parcial de um polimorfismo ancestral de C. crocoides, uma vez que é sabido que o fluxo gênico atual é limitado entre as populações. A fragmentação da população pelas atividades humanas também pode aumentar artificialmente a diferenciação genética entre as populações ao longo do tempo. Resultados provenientes das análises citogenéticas mostraram que C. crocoides é uma espécie diploide (2n=14), número cromossômico básico x=7, com o cariótipo claramente assimétrico, sendo marcado pela bimodalidade. A avaliação da arquitetura cariotípica é de extrema relevância 5 para inferências acerca da evolução cromossômica na família Iridaceae uma vez que a grande diversidade de números e tamanhos cromossômicos encontrada resulta da ocorrência de eventos de rearranjos cromossômicos, disploidias e poliploidia. A assimetria cariotípica, provavelmente resultante de inversões e/ou translocações, sugere a evolução recente de C. crocoides, embora uma alta viabilidade polínica tenha sido observada. Mesmo que alterações cromossômicas resultassem em diminuição da fertilidade, provavelmente a presença de bulbos em C. crocoides permita a sobrevivência da espécie via reprodução assexuada. Os dados gerados por este trabalho são inéditos e ampliam o conhecimento acerca do gênero Calydorea, e principalmente da espécie C. crocoides. A associação de dados moleculares e citogenéticos, bem como de caracteres morfológicos permitirá uma melhor compreensão dos processos evolutivos que envolvem este grupo de espécies. / The genus Calydorea, which belongs to the family Iridaceae, comprises about 16 species and occurs exclusively in South America. Among these species, Calydorea crocoides Ravenna highlights for being a bulbous, perennial species which occurs predominantly in the Southern Brazil, in the Campos de Cima da Serra region in Rio Grande do Sul. This region contains numerous endemic plants and is considered particularly important in the conservation approaches and studies concerning the diversification patterns in a subtropical environment transition. The Campos de Cima da Serra region is very disturbed by agricultural and extractive practices, which undoubtedly provides a natural laboratory for studying the origin and biodiversity conservation. The present study aimed to investigate the genetic variability and characterize with cytogenetic tools Calydorea crocoides occurring in southern Brazil. The results of the analysis of genetic variability using seven Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) markers to 235 individuals from eight populations of C. crocoides sampled in the states of RS and SC showed that the genetic diversity detected at the population level was low, however the species level was relatively high indicating a moderate population structuring. Species with limited geographical distribution range tend to maintain lower levels of genetic variation than species with wide geographic distribution. High genetic diversity is expected to be found in a species that has long life, a high frequency of gene flow and seed dispersal. Species with low gene flow, a result observed in C. crocoides, tend to have higher genetic differentiation than species with high gene flow reflecting a degree of spatial isolation, although there was no correlation between geographic distance and genetic distance. Probably the current level of genetic diversity is only a partial reflection of an ancestral polymorphism of C. crocoides, since it is known that the current flow is restricted among populations. The fragmentation of populations by human activities can also artificially increase the genetic differentiation among populations over time. Results from the cytogenetic analyses showed that C. crocoides is a diploid species (2n = 14), basic chromosome number x = 7, with the karyotype clearly asymmetrical, being characterized by bimodality. The evaluation of karyotype architecture is very important for inferences about chromosomal evolution in the family Iridaceae since the great diversity of chromosomal numbers and sizes found, results from the occurrence of chromosomal 7 rearrangements, disploidy and polyploidy. The karyotype asymmetric, probably resulting from inversions and/or translocations, suggests a recent evolution of C. crocoides, although a high pollen viability has been observed. Even chromosomal changes resulted in decreased fertility, probably the presence of bulbs in C. crocoides allow the survival of the species through asexual reproduction. The data generated by this work extend the knowledge about the genus Calydorea and especially for the species C. crocoides. The association of molecular and cytogenetic data as well as morphological characters allowed better understand the evolutionary processes involving this group of species.

O Brasil tem uma posição de destaque no setor de negócios avícola mundial. Esta posição é resultado de uma atividade com alto grau de desenvolvimento tecnológico, destacando-se os avanços na área da genética. Características produtivas importantes têm sido o foco dos melhoristas de galinhas. Entretanto, em termos de selecionar aves visando o aumento da resistência a doenças, pouco ou nada tem sido feito. Recentemente, a avicultura nacional voltou-se para o resgate desta característica e uma série de linhagens mais rústicas, as chamadas linhagens caipiras, têm sido desenvolvidas. Este resgate, porém tem se baseado apenas em traços fenotípicos de rusticidade, não se levando em consideração as bases da genética molecular dos mesmos. A grande maioria das doenças que atacam as galinhas é de origem vírica, sendo os genes B-F (classe I- do MHC) os principais responsáveis pelo desencadeamento da resposta imune a estes agentes. Logo, tornam-se necessárias maiores investigações nestes genes para obter-se um melhor conhecimento sobre a imunidade aos vírus, possibilitando medidas que incrementem esta imunidade. Tais investigações ainda não tinham sido realizadas em galinhas caipiras brasileiras. Das técnicas utilizadas para genotipar os genes B-F o seqüenciamento de DNA é a única que apresenta 100% de fidelidade; entretanto, é cara e trabalhosa. Assim, técnicas mais ágeis e baratas e que apresentem resultados significantes para esta finalidade são sempre pertinentes. Recentemente, um microssatélite (LEI0258) foi descrito numa localização muito próxima da região dos genes B-F, o qual tem-se mostrado uma ótima ferramenta para genotipar os haplótipos B-F; mas novamente, não havia estudos a respeito em aves caipiras. Este trabalho teve por finalidade investigar a variabilidade dos genes B-F, através da técnica de seqüenciamento do DNA, e deduzir as seqüências de aminoácidos codificadas pelos alelos destes genes encontrados em galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis. Concomitantemente, procurou-se estudar o polimorfismo do microssatélite LEI0258 em duas populações desses animais (caipiras de ovos azuis criadas livremente e a linhagem caipira Paraíso Pedrês), assim como a relação dos alelos LEI0258 com os alelos ou haplótipos B-F na amostra de aves de ovos azuis. Os resultados e conclusões alcançados podem ser resumidos como segue: 1. Vinte e seis diferentes seqüências nucleotídicas B-F de DNA, que correspondem ao fragmento que vai do exon 2 ao 4 destes genes, foram detectadas na amostra de galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis. Dez seqüências foram similares as já descritas para aves comerciais mas 16 foram inéditas. Este resultado demonstra uma grande variabilidade, a maioria da qual ainda não detectada, apresentada por estes genes nestas aves. Em alguns animais foram amplificados os dois genes B-F (B-FI e B-FIV) mas em outros, aparentemente, apenas um deles. Conclui-se que em algumas aves o fragmento analisado possa ser idêntico para os dois genes, e portanto a mesma seqüência para ambos esteja sendo detectada. Entretanto, é possível que alterações na seqüência alvo dos iniciadores utilizados possam impedir a amplificação de determinados alelos. 2. Foi observada a diferença de expressão apresentada pelos genes B-F na análise do cDNA de três animais que diferiram quanto ao número de seqüências de DNA amplificadas. (a) animal no. 169 (*CC1/*CC12): dos oito clones analisados, cinco foram *CC1 e três *CC12; (b) no. 125 (*CC7-1/*CC7-2/*CC13): 14 clones, 13 *CC7-1, um *CC13, nenhum *CC7-2; e (c) no. 132 (*CC3-1/*CC3-2/*CC4-1/*CC4-2): seis clones, três *CC3-1, três *CC4-1, nenhum *CC3-2 ou *CC4-2. A ausência de amplificação dos clones *CC3-2, *CC4-2 e *CC7-2 deve ter sido devida aos seus baixos níveis de expressão. O fato de que, dos 14 clones analisados do animal 125, 13 foram *CC7-1 sugere que, além da diferença de expressão entre os lócus B-F, pode haver também diferenças de expressão entre alelos B-F dentro de um mesmo lócus. 3. Trinta e nove diferentes seqüências de aminoácidos dos domínios 1 e 2 foram geradas a partir de 45 seqüências nucleotídicas (23 obtidas no presente trabalho e outras 22 retiradas da literatura). Três outras seqüências caipiras (*CC18, *CC19 e *CC20) determinadas posteriormente a esta análise, não foram incluídas na predição. Das 13 seqüências caipiras ainda inéditas utilizadas, dez condicionam diferenças na composição de aminoácidos quando comparadas com as já descritas. Estas são de particular interesse em futuras investigações de diferenças na resposta a patógenos. 4. Ao todo foram encontrados 15 alelos LEI0258, e o tamanho destes variou de 205 a 457 pb. Nove alelos mostraram-se presentes nas duas populações, e cada população apresentou três alelos específicos. Este grande polimorfismo habilita este microssatélite a ser utilizado como um bom marcador molecular para estudos futuros de variabilidade populacional, de paternidade e de endogamia, entre outros. 5. Foi observado um desequilíbrio de ligação total entre o lócus do microssatélite e os lócus B-F. Esta associação permite a tipagem parcial dos haplótipos B-F através deste microssatélite. Nos casos em que não se tem alelos deste microssatélite exclusivos para cada um dos haplótipos B-F, pode-se utilizá-los associados à técnica de PCR alelo-específico (PCR-SSP), pois a verificação da ocorrência de um alelo LEI0258 específico restringiria a determinação para dois ou três haplótipos B-F apenas, o que, de qualquer modo, é mais acessível do que o seqüenciamento. Esta associação também capacita os alelos LEI0258 a serem utilizados em programas de melhoramento genético de resistência a patógenos através da seleção assistida por marcadores, já que é mais fácil e rápido analisar uma população pelo método da PCR do que pelo do seqüenciamento. / Brazil has a distinguished position in the world of poultry business. This position is due to an activity involving a high degree of technological development, with emphasis in the advances in the area of genetics. Important production characteristics have been the focus of chicken breeders. However, in the area of disease resistance nothing, or very little, have been done. Recently the Brazilian poultry breeders turned to the investigation of this characteristic, and a series of rustic lines, the so-called “caipira” lines, had been developed. But these studies are based just in phenotypic traits, no consideration being given to their molecular genetic bases. The large majority of the diseases which attack chickens is of viral origin, the B-F (MHC class I-) genes being the main responsible for the development of the immune response to these agents. Therefore, more investigation on these genes is needed, to obtain a better knowledge of this viral immunity, thus making possible measures that would enhace such immunity. Investigations of this type had not been performed to date in Brazilian Caipira chicken. Of the techniques used to genotype the B-F genes, DNA sequencing is the only one that is 100% reliable; however, it is costly and demand much work. Easier and more cheap techniques, which would give significant results for this task, are naturally welcome. Recently a microsatellite (LEI0258) was described which is located in a region that is close to that of the B-F genes, and this microsatellite is being used with good results to genotype the B-F haplotypes; but again, no such studies had been performed in Brazilian Caipira chickens with this purpose. The objective of this work is to investigate the variability of the B-F genes through DNA sequencing, and to deduce the amino acid sequences which are coded by the alleles of these genes which are found in blue-egg Caipira Brazilian chicken. Concomitantly the polymorphism of the LEI0258 microsatellite was investigated in two populations of such animals (blue-egg Caipira chicken raised freely, and the Paraíso Pedrês Caipira line), as well as the relationship between the LEI0258 alleles with B-F alleles or haplotypes in the blue-egg Caipira sample. The results and conclusions found can be summarized as follows: 1. Twenty-six different DNA B-F nucleotide sequences were detected in the Brazilian blue-egg Caipira chickens. They correspond to a fragment located between exons 2 and 4 of these genes. Ten sequences were similar to those already described for commercial fowl, but 16 had not been described to date. This result indicates a large variability, the majority of which was undetected, for these genes in these birds. In some animals the two B-F (B-FI and B-FIV) genes had been amplified, but in others, apparently, just one. The inference is that in some birds the analyzed fragment could be the same for both genes, and that therefore the same sequence for both was being detected. However, it is possible that changes in the primers’ target sequences may prevent the amplification of certain alleles. 2. Expression differences in the B-F genes were observed in the cDNA analysis of these animals, which differed in the number of amplified DNA sequences. (a) Animal no. 169 (*CC1/*CC12): of the eight clones analyzed, five were *CC1 and three CC12; (b) no. 125 (*CC7-1/*CC7-2/*CC13): 14 clones, 13 *CC7-1, one *CC13, none *CC7-2; and (c) no. 132 (*CC3-1/*CC3-2/*CC4-1/*CC4-2): six clones, three *CC3-1, three *CC4-1, none *CC3-2 or *CC4-2. The absence of amplification of the *CC3-2, *CC4-2, and *CC7-2 clones can be due to their low expression levels. The fact that of the 14 clones recovered from animal 125 13 were *CC7-1 suggests that besides the B-F interloci expression differences, B-F intralocus differences may occur as well. 3. Thirty-nine different amino acid sequences from the 1 and 2 domains were generated from 23 nucleotide sequences obtained in the present work and 22 others reported in the literature. Three other Caipira sequences (*CC18, *CC19, and *CC20), determined after this analysis, were not included in it. Of the 13 new Caipira sequences used, ten condition amino acid differences in relation to those already described. They are, therefore, of special interest in future investigations related to responses to pathogens. 4. A total of 15 LEI0258 alleles were found, and their sizes varied from 205 to 457 bp. Nine alleles occurred in both populations while each population presented three specific alleles. This high degree of polymorphism determines that this microsatellite should be useful as a molecular marker in future studies of population variability, paternity, and inbreeding, among others. 5. A total linkage desequilibrium was found between the LEI0258 and B-F loci. This association allows partial typing of the B-F haplotypes through this microsatellite. In cases in which there is no microsatellite allele which is exclusive to a given B-F haplotype, the system can still be used associated to the allele-specific PCR (SSP-PCR) technique, since the establishment of the occurrence of a specific LEI0258 allele would restrict the determination to two or three B-F haplotypes only, simplifying the process in relation to sequencing. This association also allows the LEI0258 to be used in genetic breeding programs of pathogen-resistance based on markers assisted selection, since it would be easier and faster to analyze a population using PCR instead of sequencing methods.