OSTERNE, Vinícius José da Silva. Estudos de estrutura-função da lectina de sementes de Canavalia virosa com atividade inflamatória e citotóxica: uma potencial ferramenta anticâncer. 2016. 93 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-19T17:48:06Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_vjsosterne.pdf: 3164350 bytes, checksum: b51322fbcf7170442ebefb8cdf05d016 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-23T20:17:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_vjsosterne.pdf: 3164350 bytes, checksum: b51322fbcf7170442ebefb8cdf05d016 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T20:17:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_vjsosterne.pdf: 3164350 bytes, checksum: b51322fbcf7170442ebefb8cdf05d016 (MD5) Previous issue date: 2016 / Lectins are proteins that bind specifically to carbohydrates and are capable of forming complexes with molecules containing saccharides without changing the structure of the glycosil ligands. Because of the diverse biological activities displayed by these proteins they have great applicability in biotechnology. In this context, this work reports the obtention of primary and three-dimensional structures of lectin extracted from Canavalia virosa seeds, called ConV, In addition to the analysis of its effects on inflammatory process and as cytotoxic agent for glioma cells. The Canavalia virosa plant belongs to the legume family, subtribe Diocleinae. The largest number of studies with lectins focuses on this family and the subtribe Diocleinae are noteworthy due to the presence of highly studied lectins such as ConA. Lectins from Diocleinae have high structural similarity but differ on the results of biological activities, which may be explained by the structural study of proteins. ConV was purified by a single step by affinity chromatography with Sephadex G-50 matrix. The amino acid sequence of the lectin was obtained by mass spectrometry and showed high similarity to other plant lectins derived from the same subtribe. ConV crystals used for determination of the three dimensional structure were obtained by vapor diffusion method at 293 K and belonged to orthorhombic space group P21221 with a dimer in its asymmetric unit. The structure was solved at 2.53 Å and the methodology chosen to solve the phase problem was the molecular replacement using coordinates of the lectin from Canavalia maritima (PDB: 2CWM). The structure obtained after all the refinements presented Rfactor and Rfree of 18.91% and 24.92% respectively, with no residues in not allowed regions of Ramachandran plot. The obtained structure proved to be very similar to other lectins from the same gender. In inflammatory tests, ConV elicited edema, increasing the animal’s paw volume, and the incubation of lectin with glucose before the application was able to reduce the edematogenic effect indicating the involvement of the carbohydrate recognition domain in this process. ConV showed high toxicity to glioma cells with IC 50 of 58.8 µg/mL, this toxicity is probably caused by the induction of autophagy in these cells, indicating a anticancer potential for the lectin. In silico studies confirmed that ConV interacts preferentially with dimmanosides and trimmanosides, carbohydrates that compose the N-glycans of glycoproteins. This finding corroborates with the hypothesis that the lectin domain interacts with receptors containing mannosides and this contributes to the effects observed in biological activities. / Lectinas são proteínas que se ligam de forma específica a carboidratos e são capazes de formar complexos com moléculas contendo sacarídeos, sem alterar a estrutura covalente dos ligantes glicosídicos. Devido as diversas atividades biológicas apresentadas por essas proteínas, elas possuem grande aplicabilidade em biotecnologia. Nesse contexto, o presente trabalho relata a obtenção das estruturas primária e tridimensional da lectina extraída de sementes de Canavalia virosa, denominada ConV, além da investigação dos seus efeitos no processo inflamatório e como agente citotóxico para células de glioma. A planta Canavalia virosa pertence a família das leguminosas, subtribo Diocleinae. A maior quantidade de estudos com lectinas se concentram nesta família e a subtribo Diocleinae merece destaque devido a presença de lectinas altamente estudadas como a ConA. As lectinas de Diocleinae apresentam alta similaridade estrutural mas apresentam diferenças nos resultados de atividades biológicas, o que pode ser explicado pelo estudo estrutural dessas proteínas. ConV foi purificada em um único passo em cromatografia de afinidade com matriz de Sephadex-G50. A sequência de aminoácidos da lectina foi obtida por espectrometria de massas e apresentou alta similaridade com outras lectinas extraídas de plantas da mesma subtribo. Cristais de ConV utilizados para determinação da estrutura tridimensional foram obtidos pelo método de difusão de vapor a 293 K, apresentaram grupo espacial ortorrômbico P21221 com um dímero na unidade assimétrica. A estrutura foi resolvida a 2,53 Å e a metodologia escolhida para resolver o problema da fase foi a substituição molecular utilizando-se as coordenadas da lectina de Canavalia maritima (PDB: 2CWM) que demonstra 99% de similaridade com ConV. A estrutura obtida após todos os refinamentos apresentou Rfactor e Rfree de 18,91% e 24,92% respectivamente com nenhum resíduo em regiões não permitidas do gráfico de Ramachandran. A estrutura obtida se mostrou bastante semelhante a outras lectinas dos mesmo gênero. Nos ensaios de inflamação, ConV elicitou edema, aumentando o volume da pata dos animais, e a incubação da lectina com glicose antes da aplicação foi capaz de reduzir o efeito edematogênico indicando a participação do domínio de reconhecimento a carboidrato nesse processo. ConV apresentou alta toxicidade para células de glioma com IC50 de 58,8 µg/mL, essa toxicidade provavelmente é causada por indução de autofagia dessas células, indicando potencial anticâncer para a lectina. Estudos in silico confirmaram que ConV interage preferencialmente com dimanosídeos e trimanosídeos, carboidratos que compõem os N-glicanos de glicoproteínas. Esse dado corrobora com a hipótese que o domínio lectínico interage com receptores contendo manosídeos e isso contribui para os efeitos observados nas atividades biológicas.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectins are proteins that bind carbohydrates specifically and reversibly. The legume lectins represent the best studied and established group, from the point of view of physical-chemical and biological and structural, where a well-studied group of these proteins involves lectin obtained from members of the subtribe Diocleinae. Lectins Diocleinae have a high degree of structural similarity, but the same was not true regarding biological activities. This variability, as a rule, is in the detail that can be analyzed in structures based studies. In this context, multiple cardiovascular disease and inflammatory processes, particularly chronic and recurrent nature, arouse the interest of the scientific community because they require a wider range of drugs for therapeutic alternatives. In this sense, they become important research seeking new compounds with vasorelaxant and anti-inflammatory action. The present paper describes the partial structural and biological characterization of two lectins present in Canavalia virosa and Canavalia oxyphylla seeds, belonging to the family Leguminosae, subfamily Papilionoideae, Phaseoleae tribe, subtribe Diocleinae. The lectin from Canavalia virosa seeds (ConV) was purified in a single step by affinity chromatography on mannose-Sepharose 4B column. ConV strongly agglutinated rabbit erythrocytes and was inhibited by monosaccharide (D-mannose, D-glucose and α-methyl-D-manosÃdeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). SDS-PAGE revealed three bands, corresponding to three chains (α, β, γ and) confirmed by ESI mass spectrometry with masses of 25.480  2 Da, 12.864  1 Da and 12,633  1 Da, respectively. The hemagglutination activity of ConV is great in pH 7.0 to 9.0, stable at a temperature of 80 C, and is not affected by EDTA. ConV showed no toxicity against Artemia sp. and relaxed the endothelized rat aorta, with the participation of the lectin domain. In our tests, the lectin immobilized on CNBr-Sepharose was able to bind 0.8 mg of ovalbumin by chromatography, allowing the use of ConV as a tool to capture and purification of glycoproteins. Moreover, the lectin from Canavalia oxyphylla (CoxyL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. SDS-PAGE showed that pure lectin consists of a major band of 30 kDa (α chain) and two minor components (β and γ chains) of 16 and 13 kDa, respectively. These data were further confirmed by mass spectrometry via electrospray ionization. Compared to the average molecular weight of the α chains, the partial amino acid sequence obtained corresponds to about 45% of the total sequence CoxyL. CoxyL showed hemagglutinating activity was specifically inhibited by monosaccharide (D-glucose, D-mannose and methyl-α-D-manosÃdeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Furthermore, CoxyL proved to be heat stable at 60 C, and its activity is optimal at pH 7.0. CoxyL caused toxicity in Artemia sp. and induced paw edema in rats. / Lectinas sÃo proteÃnas que se ligam a carboidratos de forma especÃfica e reversÃvel. As lectinas de leguminosas representam o grupo mais bem estudado e estabelecido, tanto do ponto de vista de caracterizaÃÃo fÃsico-quÃmica e biolÃgica como estrutural, onde um grupo bem estudado destas proteÃnas envolve lectinas obtidas de membros da subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porÃm o mesmo nÃo se observa quanto Ãs atividades biolÃgicas. Esta variabilidade, via de regra, està em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. Neste contexto, mÃltiplos processos patolÃgicos cardiovasculares e inflamatÃrios, principalmente de natureza crÃnica e recorrente, despertam o interesse da comunidade cientÃfica por requererem uma maior variedade de fÃrmacos para alternativas terapÃuticas. Neste sentido, tornam-se importantes pesquisas que busquem novos compostos, com aÃÃo vasorrelaxante e anti-inflamatÃria. Assim, o presente trabalho descreve a caracterizaÃÃo estrutural parcial e biolÃgica de duas lectinas presentes em sementes de Canavalia virosa e Canavalia oxyphylla, pertencentes à famÃlia Leguminosae, subfamÃlia Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina de sementes de Canavalia virosa (ConV) foi purificada em uma Ãnica etapa atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sepharose-mannose 4B. ConV aglutinou fortemente eritrÃcitos de coelho e foi inibida por monossacarÃdeos (D-manose, D-glicose e α-metil-D-manosÃdeo) e glicoproteÃnas (ovalbumina e fetuÃna). SDS-PAGE revelou trÃs bandas, correspondentes a trÃs cadeias (α, β, e γ) confirmadas por espectrometria de massas ESI com massas de 25,480Â2 Da, 12,864Â1 Da e 12,633Â1 Da, respectivamente. A atividade hemaglutinante da ConV à Ãtima nos pH 7.0 a 9.0, estÃvel a uma temperatura de 80 ÂC, e nÃo à afetada pelo EDTA. ConV nÃo demonstrou toxicidade contra nÃuplios de Artemia sp. e relaxou a aorta endotelizada de ratos, com a participaÃÃo do domÃnio da lectina. Em nossos testes, a lectina imobilizada em CNBr-Sepharose foi capaz de se ligar a 0,8 mg de ovalbumina por cromatografia, permitindo o uso de ConV como uma ferramenta para a captura e purificaÃÃo de glicoproteÃnas. Por outro lado, a lectina de Canavalia oxyphylla (CoxyL) foi purificada em um Ãnico passo atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50.SDS-PAGE mostrou que a lectina pura consiste de uma principal banda de 30 kDa (cadeia α) e dois componentes menores (cadeias β e γ) de 16 e 13 kDa, respectivamente. Estes dados foram adicionalmente confirmados por espectrometria de massas por ionizaÃÃo por eletropulverizaÃÃo. Em comparaÃÃo com a massa molecular mÃdia das cadeias α, a sequÃncia parcial de aminoÃcidos obtida corresponde a aproximadamente 45% da sequÃncia total de CoxyL. CoxyL apresentou atividade hemaglutinante que foi especificamente inibida por monossacarÃdeos (D-glicose, D-manose, e α-metil-D-manosÃdeo) e glicoproteÃnas (ovalbumina e fetuÃna). AlÃm disso, CoxyL mostrou ser termoestÃvel a 60 C, e sua atividade à Ãtima no pH 7,0. CoxyL causou toxicidade em nÃuplios de Artemia sp. e induziu edema de pata em ratos.

LEITÃO, Cíntia Camurça Fernandes. Caracterização estrutural parcial e biológica de duas lectinas do gênero Canavalia. 2015. 80 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Vitor Campos (vitband@gmail.com) on 2016-09-01T23:25:08Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_ccfleitao.pdf: 6460190 bytes, checksum: 6ff95b685ea2f9836771bc15fb9edf9f (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T21:25:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_ccfleitao.pdf: 6460190 bytes, checksum: 6ff95b685ea2f9836771bc15fb9edf9f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T21:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_ccfleitao.pdf: 6460190 bytes, checksum: 6ff95b685ea2f9836771bc15fb9edf9f (MD5) Previous issue date: 2015 / Lectins are proteins that bind carbohydrates specifically and reversibly. The legume lectins represent the best studied and established group, from the point of view of physical-chemical and biological and structural, where a well-studied group of these proteins involves lectin obtained from members of the subtribe Diocleinae. Lectins Diocleinae have a high degree of structural similarity, but the same was not true regarding biological activities. This variability, as a rule, is in the detail that can be analyzed in structures based studies. In this context, multiple cardiovascular disease and inflammatory processes, particularly chronic and recurrent nature, arouse the interest of the scientific community because they require a wider range of drugs for therapeutic alternatives. In this sense, they become important research seeking new compounds with vasorelaxant and anti-inflammatory action. The present paper describes the partial structural and biological characterization of two lectins present in Canavalia virosa and Canavalia oxyphylla seeds, belonging to the family Leguminosae, subfamily Papilionoideae, Phaseoleae tribe, subtribe Diocleinae. The lectin from Canavalia virosa seeds (ConV) was purified in a single step by affinity chromatography on mannose-Sepharose 4B column. ConV strongly agglutinated rabbit erythrocytes and was inhibited by monosaccharide (D-mannose, D-glucose and α-methyl-D-manosídeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). SDS-PAGE revealed three bands, corresponding to three chains (α, β, γ and) confirmed by ESI mass spectrometry with masses of 25.480 ± 2 Da, 12.864 ± 1 Da and 12,633 ± 1 Da, respectively. The hemagglutination activity of ConV is great in pH 7.0 to 9.0, stable at a temperature of 80° C, and is not affected by EDTA. ConV showed no toxicity against Artemia sp. and relaxed the endothelized rat aorta, with the participation of the lectin domain. In our tests, the lectin immobilized on CNBr-Sepharose was able to bind 0.8 mg of ovalbumin by chromatography, allowing the use of ConV as a tool to capture and purification of glycoproteins. Moreover, the lectin from Canavalia oxyphylla (CoxyL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. SDS-PAGE showed that pure lectin consists of a major band of 30 kDa (α chain) and two minor components (β and γ chains) of 16 and 13 kDa, respectively. These data were further confirmed by mass spectrometry via electrospray ionization. Compared to the average molecular weight of the α chains, the partial amino acid sequence obtained corresponds to about 45% of the total sequence CoxyL. CoxyL showed hemagglutinating activity was specifically inhibited by monosaccharide (D-glucose, D-mannose and methyl-α-D-manosídeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Furthermore, CoxyL proved to be heat stable at 60° C, and its activity is optimal at pH 7.0. CoxyL caused toxicity in Artemia sp. and induced paw edema in rats. / Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos de forma específica e reversível. As lectinas de leguminosas representam o grupo mais bem estudado e estabelecido, tanto do ponto de vista de caracterização físico-química e biológica como estrutural, onde um grupo bem estudado destas proteínas envolve lectinas obtidas de membros da subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porém o mesmo não se observa quanto às atividades biológicas. Esta variabilidade, via de regra, está em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. Neste contexto, múltiplos processos patológicos cardiovasculares e inflamatórios, principalmente de natureza crônica e recorrente, despertam o interesse da comunidade científica por requererem uma maior variedade de fármacos para alternativas terapêuticas. Neste sentido, tornam-se importantes pesquisas que busquem novos compostos, com ação vasorrelaxante e anti-inflamatória. Assim, o presente trabalho descreve a caracterização estrutural parcial e biológica de duas lectinas presentes em sementes de Canavalia virosa e Canavalia oxyphylla, pertencentes à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina de sementes de Canavalia virosa (ConV) foi purificada em uma única etapa através de cromatografia de afinidade em coluna Sepharose-mannose 4B. ConV aglutinou fortemente eritrócitos de coelho e foi inibida por monossacarídeos (D-manose, D-glicose e α-metil-D-manosídeo) e glicoproteínas (ovalbumina e fetuína). SDS-PAGE revelou três bandas, correspondentes a três cadeias (α, β, e γ) confirmadas por espectrometria de massas ESI com massas de 25,480±2 Da, 12,864±1 Da e 12,633±1 Da, respectivamente. A atividade hemaglutinante da ConV é ótima nos pH 7.0 a 9.0, estável a uma temperatura de 80 ºC, e não é afetada pelo EDTA. ConV não demonstrou toxicidade contra náuplios de Artemia sp. e relaxou a aorta endotelizada de ratos, com a participação do domínio da lectina. Em nossos testes, a lectina imobilizada em CNBr-Sepharose foi capaz de se ligar a 0,8 mg de ovalbumina por cromatografia, permitindo o uso de ConV como uma ferramenta para a captura e purificação de glicoproteínas. Por outro lado, a lectina de Canavalia oxyphylla (CoxyL) foi purificada em um único passo através de cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50.SDS-PAGE mostrou que a lectina pura consiste de uma principal banda de 30 kDa (cadeia α) e dois componentes menores (cadeias β e γ) de 16 e 13 kDa, respectivamente. Estes dados foram adicionalmente confirmados por espectrometria de massas por ionização por eletropulverização. Em comparação com a massa molecular média das cadeias α, a sequência parcial de aminoácidos obtida corresponde a aproximadamente 45% da sequência total de CoxyL. CoxyL apresentou atividade hemaglutinante que foi especificamente inibida por monossacarídeos (D-glicose, D-manose, e α-metil-D-manosídeo) e glicoproteínas (ovalbumina e fetuína). Além disso, CoxyL mostrou ser termoestável a 60° C, e sua atividade é ótima no pH 7,0. CoxyL causou toxicidade em náuplios de Artemia sp. e induziu edema de pata em ratos.