It has been well-known that VILIP-1 but not VILIP-3 regulates the activity of guanylyl cyclase-B. In order to identify the modulated region within VILIP-1 on regulating guanylyl cyclase-B activity, the recombinant myristoylated and nonmyristoylated VILIPs (VILIP-1, VILIP-3, chimeric VILIPs, and mutant VILIP-1) were prepared in the present study. The recombinant proteins were purified using ion-exchanger chromatography followed by gel filtration. CD spectra indicated that the secondary structure of VILIPs was dominant with £\-helix, reflecting a well-conserved EF-hand structure. Tryptic digestion assay and the fluorescence measurement showed that myristoylation, Ca2+ and Mg2+ differently induced the conformational changes of VILIPs. The results of gel filtration chromatography reflected that the EF-3&4 of VILIP-1 and myristoylation were involved in the dimerization of VILIP-1, and the dimer and monomer were converted each other in a dynamic manner. The porcine brain membrane binding assay and liposome binding assay showed that the binding capability of VILIPs were markedly enhanced by myristoylation, Mg2+ and Ca2+. Myristoylation and the intact EF-1 of VILIP-1 were found to essential for the regulation of guanylyl cyclase activity in the presence of Mg2+ and Ca2+. Taken together, theses results suggest that myristoylation and EF hand-1 of VILIP-1 are the structural elements crucial for regulating the guanylyl cyclase activity. In contrast to oligomerization of VILIP-1, Mg2+ and Ca2+ -induced conformational changes of VILIP-1 and enhancement of the binding of VILIP-1 with membrane by Mg2+ and Ca2+ partly but not heavily involve in the action.

Deux membres des Visinin-Like Proteins (VILIPs), VILIP-1 et VILIP-3, ont été étudiés à l'aide de deux modèles membranaires biomimétiques, les monocouches de Langmuir couplées à la microscopie à l'angle de Brewster (BAM) et les bicouches lipidiques supportées (SLB) visualisées par microscopie à force atomique (AFM). A l'aide de ces deux modèles, nous avons pu montrer que les VILIPs, protéines N-myristoylées et possédant quatre mains-EF, ont une cinétique d'interaction membranaire qui augmente en présence de calcium, probablement dû à la présence d'un mécanisme type « switch calcium-myristoyle ». En revanche, l'utilisation de protéines mutées, non myristoylées, a révélé que la présence du groupement myristoyle n'est pas le seul facteur nécessaire pour que ces protéines interagissent avec la membrane. La présence d'une région N-terminale riche en résidus lysine permettrait à cette famille de protéines d'interagir via des interactions électrostatiques avec des membranes possédant des lipides anioniques et plus particulièrement du phosphatidylinositol-4,5-biphosphate (PIP2). La présence d'un faible pourcentage de ce phosphoinositide dans la membrane est responsable de l'accélération de la vitesse d'interaction membranaire des VILIPs, ce qui est cohérent avec leur location subcellulaire in cellulo. Enfin, un nouveau modèle membranaire de bicouches lipidiques suspendues sur des pilotis peptidiques (pep-tBLM) greffés sur une surface d'or a été ensuite développé. La méthode présentée dans ce manuscrit permet de créer des tBLM, de la composition lipidique souhaitée, en utilisant un peptide pilotis spécifiquement conçu durant cette thèse. La création de ce modèle a été suivie en temps réel par imagerie de résonance plasmonique de surface (SPRi) et caractérisé par AFM et par microscopie de fluorescence / Two members of the Visinin-Like Proteins (VILIPs) family, VILIP-1 and VILIP-3, have been studied using two biomimetic membrane models, the Langmuir monolayers coupled to the Brewster angle microscopy (BAM) and the supported lipid bilayers (SLB) visualized by atomic force microscopy (AFM). Using these two models, we have shown that VILIPs, N-myristoylated proteins with four EF-hands, have a membrane interaction kinetic that increases in the presence of calcium, probably due to the presence of a "calcium-myristoyl switch" mechanism. Tn contrast, the use of unmyristoylated proteins revealed that the presence of the myristoyl group is not the only factor necessary for the interaction of these proteins with the membrane. The presence of a N- terminal lysine-rich region allows this family of proteins to interact through electrostatic interactions with membranes containing anionic lipids and particularly the phosphatidylionisitol-4,5-biphosphate (PIP2). The presence of a small percent of phosphoinositide in the membrane is responsible for the acceleration of the binding rate of VILIPs, which is consistent with their subcellular location in cellulo. Finally, a new membrane model of peptide tethered lipid bilayers (pep-tBLM) grafted onto a gold surface was developed. The method described in this manuscript allows the formation of tBLM, containing the desired lipid composition, by using a home-designed peptide as tether. The formation is followed in real time by surface plasmon resonance imaging (SPRi) and has been characterized by AFM and fluorescence microscopy