Tumore von Kopf und Hals gehen weiterhin mit einer schlechten Prognose einher. Im Rahmen einer operativen Therapie tritt Wundsekret (WS) aus, welches der Wundheilung dient. Dieses kann in Kontakt mit Tumorzellen bzw. Resttumor in der Wunde kommen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Frage nach dem Einfluss von Wundsekret auf Zellvermehrung, Chemoresistenzentwicklung, den Zellzyklus und die Induktion einer Epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) in Tumorzellen von Kopf und Hals gestellt. Hierfür wurde das WS von Tag1 und das WS von Tag 2 im Dotblot auf seine Zytokinzusammensetzung analysiert. Zwei Tumorzelllinien von Kopf und Hals, FaDu und HlaC78, wurden mit WSTag1 und WSTag2 behandelt und untersucht, welche Effekte das WS auf die Zellen hat. Verwendet wurden ein Proliferationsassay, eine Zellzyklusuntersuchung und Apoptosetestung mittels FACS, eine PCR, ein Spheroidmodell und die Lichtmikroskopie. Im WS wurden erhöhte Konzentrationen verschiedener Zytokine, insbesondere von IL-6, nachgewiesen. Gezeigt werden konnte eine gesteigerte Proliferationsrate der Tumorzellen unter WS-Behandlung, jedoch keine veränderte Verteilung der Zellzyklusphasen. In HlaC78-Zellen konnte eine vermehrte Vitalität nach Cisplatinbehandlung nachgewiesen werden. In beiden Tumorzelllinien fand sich eine vermehrte Exprimierung von Snail 1, Snail 2 und Vimentin. E-Cadherin wurde vermindert exprimiert. Twist und N-Cadherin wiesen keine Veränderungen auf. Es zeigte sich eine vermehrte Migration der Tumorzellen in die Umgebung. Die Zellen wiesen nach Behandlung mit WS vermehrt mesenchymale Zeichen auf. Es konnte kein Unterschied der Auswirkungen einer Behandlung mit WSTag1 im Vergleich zu einer Behandlung mit WSTag2 festgestellt werden. Insgesamt scheint WS in Tumorzellen von Kopf und Hals einen EMT-artigen Prozess in Gang zu setzen, also eine partial EMT (pEMT). Als mögliche Auslöser dieser Veränderungen kommen die im WS nachgewiesenen Zytokine und v. a. IL-6 in Frage. / Tumors of the head and neck continue to be associated with a poor prognosis. In the course of surgical therapy, wound fluid (WF) may come into contact with tumor cells or residual tumor in the wound. In this study, the influence of wound fluid on cell proliferation, development of chemoresistance, the cell cycle and the induction of an epithelial-mesenchymal transition (EMT) in tumor cells of the head and neck was investigated. Therefore, WF from day 1 and WF from day 2 were analyzed for their cytokine composition by Dotblot. The effects of WF from day 1 and WF from day 2 on two tumor cell lines of the head and neck, FaDu and HlaC78, were investigated using a proliferation assay, a cell cycle assay and an apoptosis assay via FACS, PCR, a spheroid model and light microscopy. Increased concentrations of various cytokines, especially IL-6, were detected in the WF. An increased proliferation rate of tumor cells under WF treatment could be shown. There was no alteration in the distribution of cell cycle phases, however. In HlaC78 cells an increased vitality after cisplatin treatment could be proven. Increased expression of Snail 1, Snail 2, and Vimentin was found in both tumor cell lines. The expression of E-cadherin was decreased. Twist and N-cadherin showed no changes. Increased migration of tumor cells to the surrounding area could be seen. Cells showed more mesenchymal signs after treatment with WF. No difference in the effects of treatment with WF from day 1 compared to treatment with WF from day 2 was observed. Overall, WF appears to initiate an EMT-like process in tumor cells of the head and neck, this is called partial EMT (pEMT). Possible inducers of these changes are the cytokines and in particular IL-6 that have been found in WF.

Impaired wound healing and the resulting chronic wounds may cause significant morbidity and mortality. In these pathogenic wound environments, the ratio of inflammatory and anti-inflammatory cytokines is highly biased to the pro-inflammatory side. While the inflammatory process is an essential step in healthy wound healing, chronic wounds remain in a constant self-sustaining state of inflammation. Thus, decreased cell proliferation, reduced matrix deposition and delayed wound closure are the results. Although various cytokine-based therapies have shown promising results on skin regeneration in preliminary studies, their overall clinical use has been considerably limited by the short half-life time of the signaling molecules due to rapid dilution and degradation in the protease-rich chronic wound environment. In this work, we explored the ability of starPoly(ethylene glycol)-GAG hydrogels to modulate the hallmarks of chronic wound development, such as the prolonged inflammation, increased cell influx and delayed proliferative phase. Therefore, different strategies were developed to shape the cytokine levels in the wound towards a more pro-regenerative direction, finally promoting the natural repair process in chronic skin wounds. By biomimetically utilizing the interactions between cytokines and the tissue ECM in a GAG-based biohybrid hydrogel, we could engineer the concentrations of various signaling factors involved in the regulation of the repair process. More in detail, we utilized customized functionalized starPEG-GAG hydrogels to (1) reduce the extensive levels of inflammatory chemokines by scavenging them via GAG component of the hydrogel and thus diminish immune cell influx in a mouse wound model; (2) locally deliver the immunomodulatory IL-4 and IL-10 to shift the signaling balance into the pro-regenerative direction and thus resolve inflammation and (3) administer pre-conjugated TGF-β to enhance myofibroblast differentiation and extracellular matrix deposition. We believe that the presented hydrogel platform may become a promising tool in the management of cytokines in regenerative applications, which can be translated towards the clinical use for the treatment of chronic wounds and other diseases characterized by uncontrolled inflammation.:1 introduction 1.1 Motivation 1.2 Current state of biomaterial-based concepts in dermal wound healing 1.3 Objective 2 fundamentals 2.1 The physiological process of wound healing 2.1.1 The role of macrophages in wound healing 2.1.2 The role of fibroblasts in wound healing 2.1.3 The role of cytokines and their interaction with the ECM 2.2 The pathophysiology of chronic wounds 2.3 Strategies for treatment of chronic wounds 2.4 Biomaterials in medicine 2.4.1 Polymers in medicine 2.4.2 Mechanical properties 2.4.3 Cellular adhesion 2.4.4 Interaction with cytokines 2.4.5 Scaffold degradability 2.4.6 StarPEG-GAG hydrogels as potential material in wound healing 3 materials & methods 3.1 Preparation of hydrogels 3.1.1 Functionalization of glass surfaces 3.1.2 Hydrogel formation with EDC - NHS chemistry 3.1.3 Hydrogel formation with thiol - maleimide chemistry 3.1.4 Rheometric measurement of hydrogel discs 3.1.5 Characterization of cytokine uptake and release 3.2 Culture of human & murine cells 3.2.1 Isolation and differentiation of murine dermal fibroblasts 3.2.2 Isolation & differentiation of murine macrophages 3.2.3 Culture of human & murine cell lines 3.3 In vitro methods 3.3.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 3.3.2 Bead-based multiplex immunoassay 3.3.3 Live/Dead Staining 3.3.4 Crystal violet staining 3.3.5 Cell proliferation assay 3.3.6 RNA extraction & analysis 3.3.7 cDNA synthesis 3.3.8 Quantitative real time rt-PCR 3.4 Statistical analysis 3.5 Software use 4 scavenging inflammatory chemokines to control immune cell influx in the wound 4.1 Results 4.1.1 Engineering heparin-based hydrogels to scavenge chemokines 4.1.2 Heparin-based hydrogels reduce migration of immune cells 4.1.3 Heparin-based hydrogels decrease wound immune cell influx and inflammatory signaling 4.2 Discussion 5 promotion of regenerative macrophage polarizationin inflammatory environments 5.1 Results 5.1.1 Reversible complexation of IL-4 & IL-10 to starPEG-heparin gels 5.1.2 Stabilizing effects of starPEG-heparin gels on IL-4 5.1.3 IL-4 & IL-10-laden starPEG-heparin hydrogels modulate macrophage polarization 5.1.4 IL-4-laden starPEG-heparin induce collagen deposition in dermal fibroblasts 5.2 Discussion 6 modulation of human dermal fibroblast proliferation and differentiation 6.1 Results 6.1.1 Reversible complexation of TGF-b to starPEG heparin gels 6.1.2 Cell attachment, spreading and proliferation 6.1.3 Matrix deposition by fibroblasts grown on starPEG-heparin hydrogels 6.1.4 Degradation of starPEG-heparin hydrogels 6.1.5 TGF-b-laden starPEG-heparin that efficiently induces myofibroblast differentiation 6.2 Discussion 7 general discussion 7.1 Summary and conclusion 7.2 Future perspective Appendix 8 supplementary materials & methods 9 declaration of authorship 10 publications and conference contributions bibliography list of figures list of tables nomenclature selbstständigkeitserklärung

Thesis (doctoral)--Universität, Würzburg, 2001.

Wound healing and scar quality after trauma are subject to impairment through excessive wound healing, chronic wound or even surgical site infections. Optimizing the process of scar formation and skin healing is crucial in virtually all fields of medicine. In this regard, we tested the possible usage and advantages of titanium coated suture material. We performed a prospective observational cohort study including 30 patients who underwent soft tissue reconstruction. One half of the donor flap site was sutured with titanium coated suture material, while the other half was closed with non-coated sutures. Scar quality of the donor flap site was assessed by photographs and POSAS scores. No difference between the titanium coated and non-titanium-coated suture material was seen in the POSAS assessment in regard to scar quality and wound healing. Comorbidities like diabetes, chronic renal failure and smoking as well as the BMI of each patient affected the wound healing process to an equal degree on both sides of the suture.The titanium-coated suture material can be considered to be equally as effective and safe in all qualities as the non-titanium-coated suture material.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine erste Bewertung eines neu entwickelten Cryogels auf Basis von acrylierter Hyaluronsäure für den Einsatz als künstliche Extrazellulärmatrix (ECM) zur Unterstützung des Wundheilungsprozesses. Zu diesem Zweck wurden die Cryogele bis zu einer Dauer von 4 Wochen mit Fibroblasten, die neben Keratinozyten, Endothel- und Immunzellen eine besondere Rolle für den Wundverschluss spielen, kultiviert. Dadurch konnten grundlegende Erkenntnisse hinsichtlich der Proliferation, Migration und Matrixsynthese gewonnen werden Ein maßgeblicher Bestandteil war dabei auch die Untersuchung der Genexpression von Kollagen-1 (coll-1), Hyaluronsynthase-2 (HAS-2) und Matrixmetalloproteinase-1(MMP-1) nach Stimulation mit den wundheilungsassoziierten Zytokinen Transforming Growth Factor β (TGF-β ) und Platelet Derived Growth Factor BB (PDGF-BB). Die Produkte der drei Gene spielen für den Wundheilungsprozess eine entscheidende Rolle, da sie wesentlich am Auf- und Umbau der ECM beteiligt sind. Zudem wurden in der Versuchsplanung die Auswirkungen auf Morphologie und Funktion der Fibroblasten bei 3-dimensionaler Kultur im Vergleich zur 2-dimensionalen Monolayerkultur berücksichtigt. Um eine bestmögliche Vergleichbarkeit zu erreichen, wurde aus diesem Grund ein 3-dimensionales Kollagengel als Kontrollmodell genutzt. Die Ergebnisse spiegeln ein physiologisches Verhalten von Fibroblasten bei Kultur in den Cryogelen wider. Die Zellen adhärieren an der Gelstruktur, proliferieren und verteilen sich im Cryogel, indem sie in die Tiefe wandern. In den mikroskopischen und makroskopischen Färbungen zeigt sich eine kontrollierte Neusynthese von ECM. Die Applikation von TGF-β und PDGF-BB führt zu einer adäquaten Reaktion der Fibroblasten und einer Regulation des Matrixstoffwechsels. Die Ergebnisse sind mit denen aus einem 3-dimensionalen Kollagengelmodell vergleichbar und stimmen im Wesentlichen mit der Literatur zur Wirkung der beiden Zytokine auf Monolayerkulturen von Fibroblasten überein. Messungen zeigen eine leichte Zunahme der Porengröße der Cryogele im zeitlichen Verlauf, was möglicherweise auf einen Abbau durch die Fibroblasten hindeutet. Die Stabilität der Gele wird dadurch jedoch nicht merklich beeinflusst. Durch ihre Zusammensetzung und grundlegende Struktur sowie den damit verbundenen Eigenschaften ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten sowohl im klinisch-therapeutischen Bereich als auch in der Forschung.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Physiologische Wundheilung 1.2. Phasen der Wundheilung 1.2.1. Exsudative Phase 1.2.2. Resorptive Phase 1.2.3. Proliferationsphase 1.2.4. Reparation/Regeneration 1.3. Rolle der Fibroblasten während der Wundheilung 1.4. Einfluss ausgewählter Zytokine auf die Wundheilung 1.5. Rolle der ECM während der Wundheilung 1.5.1. Kollagen 1.5.2. Hyaluronsäure und Hyaluronsynthasen 1.5.3. Matrixmetalloproteinasen 1.6. Probleme bei der Wundheilung und Folgen komplizierter Wunden 1.6.1. Die Brandverletzung - ein Sonderfall der akuten Wunde 1.6.2. Chronische Wunden 1.6.3. Folgen von Wunden und pathologischer Narbenbildung 1.7 Funktionelle Biomaterialien 1.8. Fragestellung und Ziele der Arbeit 2. Materialien 2.1. Nährmedien und Zusätze 2.2. Antikörper, Enzyme und Wachstumsfaktoren 2.3. Chemikalien und andere Substanzen 2.4. Verbrauchsmaterialien 2.5. Geräte 3. Methoden 3.1. Methoden der Zellkultivierung 3.1.1. Isolierung humaner Fibroblasten aus Haut 3.1.2. Dispaseverdau 3.1.3. Kollagenaseverdau 3.1.4. Passagieren der Zellen 3.1.5. Bestimmung der Zellzahl 3.1.6. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.1.7. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten in Gelen aus Kollagen Typ I 3.1.8. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf einer Kollagenbeschichtung für die XTT-Messung 3.2. Molekularbiologische Methoden 3.2.1. Isolation der RNA aus Fibroblasten in den Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.2.2. Isolation der RNA aus Fibroblasten im Kollagengel 3.2.3. Reverse Transkription in cDNA 3.2.4. Die quantitative Real-Time-Polymerasekettenreaktion 3.2.5. XTT-Assay zum Nachweis von Proliferation und metabolischer Aktivität 3.3. Histologische Methoden 3.3.1. Anfertigen von Paraffinschnitten 3.3.2. Färbemethoden der Paraffinschnitte 3.3.3. Immunhistochemie PCNA 3.4. Auswertung der Paraffinschnitte 3.5. Färbung von Gelen mit Siriusrot 3.6. Statistische Auswertung 4. Ergebnisse 4.1. Eigenschaften der Gele 4.2. Histologische Auswertung 4.2.1. Fibroblasten lassen sich im HA-Gel kultivieren 4.2.2. Fibroblasten proliferieren im HA-Gel 4.2.3. Fibroblasten bilden Kollagen und lagern dieses im Gel ein 4.2.4. Messung der Porengröße 4.3. Untersuchung der Stoffwechselaktivität und Proliferation 4.4. Analyse der Genexpression der Fibroblasten nach Stimulation mit TGF-β und PDGF-BB 4.4.1. Untersuchung der Genexpression von Kollagen Typ I 4.4.2. Untersuchung der Genexpression von HAS-2 4.4.3. Untersuchung der Genexpression von MMP-1 4.5. Zusammenfassung der Ergebnisse 5. Diskussion 5.1. Epidemiologie dermaler Verletzungen und die Notwendigkeit neuer Therapien 5.2. Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung - die Rolle der Kulturbedingungen 5.3. Cryogele aus Hyaluronsäure – ein geeignetes Substrat für die in vitro Kultur von Fibroblasten 5.4. Der Einfluss von TGF-β 1 und PDGF-BB auf den Matrixstoffwechsel der Fibroblasten 5.5. Mögliche Anwendungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für Cryogele aus Hyaluronsäure 5.6. Klinische Relevanz der Cryogele in Anlehnung an die derzeitig gültigen Leitlinien 5.7. Fazit Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Anlagen Histologische Bilder der Alcianblau-HE-Färbung Eigenständigkeitserklärung Lebenslauf Danksagung / Die erhobenen Ergebnisse dieser Dissertation zeigen, dass die Zusammensetzung, Struk-tur und damit verbundenen grundlegenden Eigenschaften die Cryogele zu einem geeig-neten Substrat für die 3-dimensionale in vitro Kultur von Fibroblastenmachen. Aus der Literatur ist bekannt, dass eine Besiedelung ähnlich gearteter Hydrogele auch mit anderen Zelltypen möglich ist. Daraus ergeben sich Optionen sowohl für die Anwendung im klinisch-therapeutischen Bereich als auch in der Forschung. Die statistischen Daten verdeutlichen den Innovati-onsbedarf für die Therapie chronischer Wunden und für Alternativen zu Voll-und Spalt-hauttransplantaten bei der Behandlung großflächiger Brandverletzungen. Um für die Be-handlung beider Wundentitäten in Betracht zu kommen, müssen Materialien zur Wund-versorgung den Anforderungen der aktuellen Therapieleitlinien gerecht werden. Aufgrund des natürlichen Vorkommens von Hyaluronsäure im dermalen Gewebe und der Möglichkeit dem körpereigenen Um-und Abbau unterworfen werden zu können, haben die Cryogele entscheidende Vorteile gegenüber bereits zugelassener Materialien, die syn-thetischen oder tierischen Ursprungs sind und nicht selten Allergien oder Fremdkörper-reaktionen hervorrufen. Weitere Eigenschaften der Cryogele lassen vermuten, dass sie mit Hilfe einiger Modifikationen den Kriterien der Leitlinien entsprechen könnten. Die 2-dimensionale Monolayerzellkultur stößt als Forschungsmedium immer dann an ihre Grenzen, wenn die erhobenen Ergebnisse nicht auf die Verhältnisse in vivo übertrag-bar sind. 3-dimensionale Zell-Zell-und Zell-Matrixkontakte sind die Grundlage für eine korrekte Zellfunktion, weswegen die Forderung nach einer Matrix für den Einsatz in der Zellforschung, die die physiologischen Verhältnisse so gut wie möglich abbilden kann, immer präsenter wird. Die Besiedlung der Cryogele aus Hyaluronsäure und anschlie-ßende Untersuchung mit unterschiedlichen Methoden erwies sichim Wesentlichen als unkompliziert. Darüber hinaus zeigten die ausgesäten Fibroblasten eine adäquates Wachstums-und Matrixsyntheseverhalten, weswegen eine Nutzung zu Forschungszwe-cken denkbar erscheint. Die gewonnen Erkenntnisse sowie die in der Diskussion behandelte Literatur und aufgezeigten Möglichkeiten zur Weiterentwicklung der Cryo-gele bilden die Basis für die Planung weiterer und richtungsspezifischerer Untersuchungen.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Physiologische Wundheilung 1.2. Phasen der Wundheilung 1.2.1. Exsudative Phase 1.2.2. Resorptive Phase 1.2.3. Proliferationsphase 1.2.4. Reparation/Regeneration 1.3. Rolle der Fibroblasten während der Wundheilung 1.4. Einfluss ausgewählter Zytokine auf die Wundheilung 1.5. Rolle der ECM während der Wundheilung 1.5.1. Kollagen 1.5.2. Hyaluronsäure und Hyaluronsynthasen 1.5.3. Matrixmetalloproteinasen 1.6. Probleme bei der Wundheilung und Folgen komplizierter Wunden 1.6.1. Die Brandverletzung - ein Sonderfall der akuten Wunde 1.6.2. Chronische Wunden 1.6.3. Folgen von Wunden und pathologischer Narbenbildung 1.7 Funktionelle Biomaterialien 1.8. Fragestellung und Ziele der Arbeit 2. Materialien 2.1. Nährmedien und Zusätze 2.2. Antikörper, Enzyme und Wachstumsfaktoren 2.3. Chemikalien und andere Substanzen 2.4. Verbrauchsmaterialien 2.5. Geräte 3. Methoden 3.1. Methoden der Zellkultivierung 3.1.1. Isolierung humaner Fibroblasten aus Haut 3.1.2. Dispaseverdau 3.1.3. Kollagenaseverdau 3.1.4. Passagieren der Zellen 3.1.5. Bestimmung der Zellzahl 3.1.6. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.1.7. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten in Gelen aus Kollagen Typ I 3.1.8. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf einer Kollagenbeschichtung für die XTT-Messung 3.2. Molekularbiologische Methoden 3.2.1. Isolation der RNA aus Fibroblasten in den Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.2.2. Isolation der RNA aus Fibroblasten im Kollagengel 3.2.3. Reverse Transkription in cDNA 3.2.4. Die quantitative Real-Time-Polymerasekettenreaktion 3.2.5. XTT-Assay zum Nachweis von Proliferation und metabolischer Aktivität 3.3. Histologische Methoden 3.3.1. Anfertigen von Paraffinschnitten 3.3.2. Färbemethoden der Paraffinschnitte 3.3.3. Immunhistochemie PCNA 3.4. Auswertung der Paraffinschnitte 3.5. Färbung von Gelen mit Siriusrot 3.6. Statistische Auswertung 4. Ergebnisse 4.1. Eigenschaften der Gele 4.2. Histologische Auswertung 4.2.1. Fibroblasten lassen sich im HA-Gel kultivieren 4.2.2. Fibroblasten proliferieren im HA-Gel 4.2.3. Fibroblasten bilden Kollagen und lagern dieses im Gel ein 4.2.4. Messung der Porengröße 4.3. Untersuchung der Stoffwechselaktivität und Proliferation 4.4. Analyse der Genexpression der Fibroblasten nach Stimulation mit TGF-β und PDGF-BB 4.4.1. Untersuchung der Genexpression von Kollagen Typ I 4.4.2. Untersuchung der Genexpression von HAS-2 4.4.3. Untersuchung der Genexpression von MMP-1 4.5. Zusammenfassung der Ergebnisse 5. Diskussion 5.1. Epidemiologie dermaler Verletzungen und die Notwendigkeit neuer Therapien 5.2. Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung - die Rolle der Kulturbedingungen 5.3. Cryogele aus Hyaluronsäure – ein geeignetes Substrat für die in vitro Kultur von Fibroblasten 5.4. Der Einfluss von TGF-β 1 und PDGF-BB auf den Matrixstoffwechsel der Fibroblasten 5.5. Mögliche Anwendungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für Cryogele aus Hyaluronsäure 5.6. Klinische Relevanz der Cryogele in Anlehnung an die derzeitig gültigen Leitlinien 5.7. Fazit Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Anlagen Histologische Bilder der Alcianblau-HE-Färbung Eigenständigkeitserklärung Lebenslauf Danksagung

Nach einer Gewebeschädigung stellt die Entzündungsreaktion den ersten essentiellen Schritt für die Wundheilung dar, deren anschließendes Auflösen den Übergang zur Phase der Gewebeneubildung einleitet. Voraussetzung für diesen Ablauf ist die Herunterregulierung der Aktivität proinflammatorischer M1-Makrophagen (M1-Ma) sowie die Induktion antiinflammatorischer M2-Makrophagen (M2-Ma). Zwischen diesen beiden Phänotypen steht ein breites Spektrum unterschiedlich aktivierter Ma, die in der Wundheilung aktiv sind. Die Auslöser für diesen wichtigen Übergang sind dabei weitgehend unbekannt. Es ist in in vitro Versuchen beschrieben, dass entzündlich aktivierte humane dermale Fibroblasten (dFb) die inflammatorische Aktivität von M1-Ma reduzieren und zusätzlich die Polarisierung von inflammatorisch aktivierten Monozyten zu M2-Ma fördern. Diese Effekte vermitteln sie über die Freisetzung immunmodulierender Mediatoren, insbesondere von TSG-6 und PGE2, einem Produkt der Cyclooxygenase 2 (COX 2). Bisher wurden diese Faktoren noch nicht im zeitlichen Verlauf der Entzündungsreaktion während der Wundheilung in einem in vivo Tiermodell untersucht. In dieser Arbeit konnte festgestellt werden, dass in dem angewendeten murinen in vivo Wundheilungsmodell die initiale Entzündungsreaktion nach 24 Stunden ihren Höhepunkt erreicht. Synchron dazu konnte erstmals gezeigt werden, dass das Auftreten von TSG-6 und COX-2 ebenfalls die höchste Expression am 1. Tag nach der Wundsetzung aufzeigt. In der Analyse der aufgetrennten Zellschichten der Haut wurde nachgewiesen, dass COX-2 in der epidermalen und dermalen Schicht exprimiert wird. Die Synthese von TSG-6 hingegen ist auf die Zellen in der dermalen Schicht beschränkt. Die Isolierung und Untersuchung von dFb aus dem restlichen Zellverband des Wundgewebes bestätigte dFb als Quelle für die TSG-6 Synthese. In einem weiteren Versuchsansatz mit entzündlich aktivierten humanen Keratinozyten wurde gezeigt, dass sie kein TSG-6 bilden können. Somit stellen die gewonnenen Erkenntnisse die Grundlagen zukünftiger Untersuchungen zum funktionalen Ablauf der Wundheilung dar, in welchem die dermalen Fibroblasten als zentrale Schlüsselrolle im Entzündungsgeschehen betrachtet werden müssen. Daraus können sich neue therapeutische Ansätze zur Modulation einer gestörten Wundheilung ergeben.:1 Einleitung 1.1 Aufbau und Funktion der Haut 1.2 Wundheilung 1.2.1 Phasen der Wundheilung 1.2.1 Bedeutung der Makrophagen in der Wundheilung 1.3 Beeinflussung der Entzündungsauflösung 1.4 Einfluss von dFb auf die Ma-Differenzierung 1.5 Aufgabenstellung 2 Materialien und Methoden 2.1 Materialien 2.1.1 Maus 2.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien 2.1.3 Software 2.1.4 Chemikalien und molekularbiologische Reagenzien 2.1.5 Antikörper und Primer 2.2 Methoden 2.2.1 Zellkultur 2.2.2 In vivo Wundheilungsmodell 2.2.3 Aufbereitung der Gewebeproben 2.2.3.1 Gesamtwundgewebe 2.2.3.2 Auftrennung der dermalen und epidermalen Schicht 2.2.3.3 Isolierung von dermalen Fibroblasten aus Wund- und Hautbiopsien 2.2.4 Histologische Analyse 2.2.5 Zellzahlbestimmung 2.2.6 Durchflusszytometrie 2.2.7 Genexpressionsanalysen 2.2.7.1 RNA- Isolierung/Konzentrations- und Reinheitsbestimmung 2.2.7.2 Herstellung von cDNA 2.2.7.3 Quantitative Echtzeit-PCR 2.2.8 Proteinbiochemische Analysen 2.2.8.1 Proteingewinnung aus Zellkulturen 2.2.8.2 Proteinisolation aus den Wund- und Hautbiopsien 2.2.8.3 Immunoassays 2.2.8.4 Analytische Auswertung der Proteinmessungen aus den Wund- und Hautbiopsien 2.2.9 Statistische Auswertung 3 Ergebnisse 3.1 Charakterisierung der Entzündungsphase 3.1.1 Wundverschluss 3.1.2 Zeitliche Expression proinflammatorischer Mediatoren 3.1.3 Zeitliche Expression antiinflammatorischer Mediatoren 3.2 Zeitliche Expression von TSG-6 und COX-2 und deren Produkte in der Gesamtwunde 3.3 Bestimmung des Ursprungs von TSG-6 und COX-2 in der Wundheilung 3.3.1 Auftrennung des Wundgewebes in Epidermis und Dermis 3.3.1.1 Charakterisierung der Schichten 3.3.1.2 Nachweis von TSG-6 und COX-2 3.3.2 Isolierung von dFb aus dem Wundrand 3.3.2.1 Charakterisierung der separierten Zellfraktionen 3.3.2.2 Nachweis von TSG-6 und COX-2 3.4 Humanes Modell: in vitro Kultur hudFb und huKC 3.4.1 Nachweis von TSG-6 und COX-2 und deren Produkte 4 Diskussion 5 Zusammenfassung der Arbeit 6 Literaturverzeichnis A Appendix A1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit A2 Erklärung über die Vorbehaltlichkeit der Verfahrenseröffnung zur Verleihung des Titels Dr. med. A3 Publikationen A4 Danksagung

Die Wundheilung stellt einen physiologischen Vorgang zur Regeneration zerstörten Gewebes dar. Der reibungslose Ablauf der Heilung wird durch ein komplexes Zusammenspiel von Zellen und extrazellulären Komponenten gewährleistet. Durch vielfältige Faktoren kann dieser fein abgestimmte Prozess zum Erliegen kommen, so dass eine chronische Wundheilungsstörung resultiert. Trotz zahlreicher Behandlungsmöglichkeiten chronischer Wunden bleibt jedoch die erfolgreiche Heilung oftmals aus. Die Anwendung von biodegradierbaren Materialen (Biomaterialien) in der Wundheilung wurde in den vergangenen Jahren intensiv erforscht und teilweise erfolgreich am Patienten eingesetzt. An dem Ziel, ein Biomaterial herzustellen, welches alle funktionellen und strukturellen Fähigkeiten gesunder menschlicher Haut mit sich bringt, wird jedoch nach wie vor gearbeitet. In verschiedenen Studien konnte die gute Verträglichkeit und Biodegradierbarkeit des Biopolymers PLGA, bestehend aus Lactat und Glycolsäure, bereits gezeigt werden. In der vorliegenden Dissertation wurden dreidimensionale (3D)-Gerüste (Scaffolds) aus PLGA hinsichtlich ihrer Wechselwirkungen mit humanen dermalen Fibroblasten (Fb) untersucht. Dermale Fb leisten einen entscheidenden Beitrag zur erfolgreichen Wundheilung, da sie unter der Einwirkung diverser Wachstumsfaktoren zur Migration ins Wundgebiet sowie zur Neusynthese und Reorganisation extrazellulärer Matrix (ECM) befähigt sind. In den Untersuchungen wurden grundlegende Kenntnisse zum Verhalten der Zellen bezüglich Proliferation sowie Synthese nativer ECM in den PLGA-Scaffolds gewonnen und das Migrationsverhalten der Fb in das Biomaterial untersucht. Dabei zeigte sich, dass dermale Fb in den PLGA-Scaffolds nicht nur proliferieren sondern auch einen ausgeprägten Matrixstoffwechsel aufweisen. Sie sind in der Lage, Kollagen und Hyaluronsäure, wichtige Bestandteile der ECM, abzulagern. Zudem konnte mit Hilfe der Arbeit der Einfluss von Wachstumsfaktoren sowohl auf relevante ECM-Komponenten im 3D-Kultursystem als auch auf das Migrationsverhalten der Fb in das Biomaterial verdeutlicht werden. Aus den Ergebnissen geht hervor, dass 3D-PLGA-Scaffolds geeignete Substrate zur Kultivierung dermaler Fb darstellen. Die zukünftig geplante Weiterentwicklung und Funktionalisierung dieses Biopolymers für den Einsatz in der Wundheilung scheint somit viel versprechend.

Der TRPV3 (transient receptor potential vanilloid 3)-Kanal ist ein nicht-selektiver, Kalzium-permeabler Kationenkanal, der hauptsächlich in epidermalen Keratinozyten exprimiert wird (Peier et al., 2002). Eine genaue Regulierung der Kalzium-Dynamik in der Epidermis der Haut spielt bei der Bildung der Hautbarriere eine entscheidende Rolle, wodurch viele Aspekte der Epidermisfunktion, einschließlich der Proliferation, Differenzierung und Migration der Keratinozyten, kontrolliert werden (Bikle & Mauro, 2014; S. E. Lee & Lee, 2018). Bei näherer Betrachtung des Einflusses des TRPV3-Kanals auf die Hauthomöostase deuten aktuelle Studien darauf hin, dass der TRPV3-vermittelte Einstrom von Kalziumionen in Keratinozyten die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Wachstumsfaktoren induziert (Cheng et al., 2010; Xu et al., 2006). Daher kann jedes Ungleichgewicht in der TRPV3-Aktivität drastische Auswirkungen auf die gesunde Funktion der Haut haben, wobei eine Kanalüberaktivität mit Hyperkeratose und Entzündungen der Haut in Verbindung gebracht werden kann. Diese Störungen der Haut sind unter anderem für Hauterkrankungen wie der atopischen Dermatitis und dem schwerwiegenden Olmsted-Syndrom, das durch gain-of-function-Mutationen des TRPV3-Kanals verursacht wird, charakteristisch (Lin et al., 2012; Yamamoto-Kasai et al., 2013). Darüber hinaus kann eine Kanalunterfunktion mit einer beeinträchtigten Hautregeneration und Wundheilung korreliert werden (Aijima et al., 2015; Miyamoto et al., 2011). Diesbezüglich wurde gezeigt, dass der TRPV3-Kanal mit dem Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF-Rezeptor) einen Signalkomplex bildet, um die Bildung der Hautbarriere zu regulieren, wobei die Aktivität von TRPV3 wahrscheinlich durch die Aktivierung des EGF-Rezeptors verstärkt wird (Cheng et al., 2010). Der TRPV3-Kanal wird ebenso durch verschiedene natürliche Verbindungen, wie Carvacrol und Thymol, oder durch synthetische Substanzen, wie 2-Aminoethoxy-diphenylborat (2-APB) aktiviert, wobei 2-APB häufig zur Untersuchung der Funktion von TRPV3 in vitro angewendet wird, da es sich hierbei um einen kostengünstigen und relativ potenten TRPV3-Aktivator handelt. 2-APB wirkt jedoch auch auf eine Vielzahl anderer TRP-Kanäle, sodass es schwierig ist, die Effekte, die durch 2-APB in nativen Geweben ausgelöst werden, auf eine Aktivierung des TRPV3-Kanals zurückzuführen (Hinman, Chuang, Bautista, & Julius, 2006; Hu et al., 2004; M. Li, Jiang, & Yue, 2006; Togashi, Inada, & Tominaga, 2008; Vogt-Eisele et al., 2007; Chokshi, Fruasaha, & Kozak, 2012; Lievremont, Bird, & Putney, 2005). Bei der früheren Durchführung eines Wirkstoffscreenings einer ChemBioNet Substanzbibliothek wurde der TRPV3-selektive Inhibitor 26E01 identifiziert (Bischof et al., 2020). Um weitere potente und spezifische TRPV3-Modulatoren zu identifizieren, wurde eine hausinterne Substanzbibliothek bestehend aus 50 chemischen Verbindungen, die im Labor von Thomas Magauer synthetisiert wurden, und die SelleckChem-Substanzbibliothek L1700 bestehend aus 4718 Verbindungen gescreent. In dieser Arbeit ist die Identifizierung, Validierung und erste Anwendung des neuen, potenten, TRPV3-selektiven Aktivators KS0365 beschrieben. Durch die Anwendung dieses neuartigen TRPV3-Aktivators konnte im Rahmen dieser Studie gezeigt werden, dass TRPV3-Aktivatoren den Reepithalisierungsprozess nach einer Verletzung der Haut fördern könnten. Diese Schlussfolgerung ist auf die in dieser Studie festgestellte Beobachtung zurückzuführen, dass infolge der Aktivierung des TRPV3-Kanals mit KS0365 in den Leading-Edges von Keratinozyten und in migrierenden Keratinozyten, die im Rahmen von Migrationsassays am Rande der erzeugten Lücke lokalisiert waren, die stärksten Anstiege der intrazellulären Kalziumionenkonzentration ausgelöst wurden und KS0365 wahrscheinlich aufgrund dieser Effekte eine Beschleunigung der Keratinozytenmigration bewirkte.:Inhaltsverzeichnis 1. Abkürzungsverzeichnis 1 2. Einleitung 5 2.1 Die Funktion von Kalzium in der Haut 5 2.2 Ionenkanäle in Keratinozyten 8 2.3 Der TRPV3-Kanal 10 3. Zielstellung und Methodenwahl 17 4. Materialien und Methoden 21 4.1 Kultivierung immortalisierter Zelllinien 21 4.2 Isolierung primärer Keratinozyten 22 4.3 Erzeugung einer stabilen m308kTRPV3-YFP-Zelllinie 23 4.4 Interne Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie 24 4.5 Small-interfering RNA (siRNA)-vermittelter Knockdown 24 4.7 Wirkstoffscreening 26 4.8 Hit-Validierung durch Erstellung von Konzentrations-Wirkungsbeziehungen 27 4.9 Selektivitätstestung 27 5.0 Analyse von synergistischen Wirkungen von TRPV3-Aktivatoren 27 5.1 Ratiometrisches Kalzium-Imaging 28 5.2 Elektrophysiologische Untersuchungen 29 5.3 Bestimmung der metabolischen Zellaktivität 29 5.4 Zellmigrations-Assays 30 5.5 Kalzium- Imaging mittels interner Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopie 30 5.6 Daten-Analyse 31 6. Ergebnisse 33 6.1 Wirkstoffscreening und Bestimmung von Konzentrations-Wirkungsbezie- hungen 33 6.2 Selektivitätstestung des neuen TRPV3-Aktivators KS0365 38 6.3 Validierung des siRNA-vermittelten TPRV3-Knockdowns 42 6.4 Kalzium-Imaging in primären Keratinozyten 44 6.5 Elektrophysiologische Untersuchungen 45 6.6. Analyse von synergistischen Wirkungen von TRPV3-Aktivatoren 49 6.7 Evaluierung der Langzeit-Tolerabilität von TRPV3-Modulatoren 50 6.8 Zellmigrations-Assays 53 6.9 Kalzium-Imaging in migrierenden Keratinozyten 58 7.0 Analyse von Kalzium-Signalen in der Leading-Edge von Keratinozyten mittels TIRF-Mikroskopie 60 8. Diskussion und Ausblick 63 9. Zusammenfassung der Arbeit 75 10. Referenzen 79 11. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 95 12. Lebenslauf 96 13. Publikationen 96 14. Wissenschaftliche Poster und Vorträge 96 15. Danksagung 97

Diabetes mellitus ist ein entscheidender Risikofaktor in der Entstehung chronischer Wunden. Hyperglykämien, oxidativer Stress und Mikro- sowie Makroangiopathien führen zu einer pathologisch veränderten Wundheilung. Erhöhte Konzentrationen pro- inflammatorischer Zytokine, neutrophiler Granulozyten, Matrix-Metalloproteasen (MMPs) und geringere Expression von Wachstumsfaktoren resultieren in einem persistierenden Inflammationszustand mit Beeinträchtigung aller Phasen der Wundheilung. Eine offene Wunde begünstigt die bakterielle Besiedlung mit Entwicklung eines polymikrobiellen Biofilms und möglicher Entstehung einer chronischen Wunde. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, herauszufinden, ob die Lokaltherapie mit Polyvinylpyrrolidon-Iod (PVP-I) und liposomalem Polyvinylpyrrolidon-Iod-Hydrogel (PVP-ILH) zu einer Biofilmreduktion in diabetischen Wunden führt. Außerdem soll untersucht werden, welchen Einfluss beide Antiseptika auf die diabetische Wundheilung, insbesondere Gewichtsveränderung, Wundgröße, Neoangiogenese (CD31), Gewebeinflammation (CD45), Wundkontraktion (Smooth Muscle Actin α (α-SMA) und Remodeling (MMP-9) sowie durch Bestimmung von Interleukin-1α (IL-1α) im murinen Serum auf die systemische Inflammation haben. Dazu wurden Untersuchungen an einem Staphylococcus aureus – Biofilm im in – vivo – Rückenhautkammermodell der diabetischen Maus (BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb (Db/Db)) nach lokaler Wundtherapie mit PVP-I oder PVP-ILH durchgeführt. PVP-I und PVP-ILH bewirkten keine signifikante Reduktion von Biofilmen. Jedoch war eine reduzierte bakterielle Aktivität in oberflächlicher und tiefere Muskelschicht nach PVP- ILH-Therapie zu beobachten, während nach PVP-I-Therapie weiterhin Biofilme in allen Schichten nachweisbar waren. PVP-ILH und PVP-I zeigten keinen signifikanten Einfluss auf die Wundgrößenreduktion. Jedoch wurden signifikant geringere Gewichtsverluste nach PVP- ILH-Therapie und eine nicht signifikante Reduktion von Gewichtsverlusten nach PVP-I- Therapie beobachtet. PVP-ILH und PVP-I zeigten keinen signifikanten Einfluss auf Gewebeinflammation oder Wundkontraktion. PVP-ILH demonstrierte die höchste, jedoch nicht signifikante Neoangiogenese (CD31). Weder PVP-I noch PVP-ILH hatten einen Effekt auf das Remodeling (α-SMA) oder die lokale Inflammation (CD45). PVP-I bewirkte jedoch eine signifikante Reduktion der systemischen Inflammation (IL-1α). Die Daten lassen vermuten, dass PVP-I und PVP-ILH zu einer Bakterienreduktion in chronischen Wunden beitragen, obwohl sie in unserer Studie zu keiner signifikanten Biofilmeradikation führten. Die signifikant geringeren Gewichtsverluste in der mit PVP-ILH behandelten Gruppe sowie die signifikant geringere systemische Inflammation in der mit PVP-I behandelten Gruppe verdeutlichen positive Effekte beider Antiseptika in der Lokaltherapie Biofilm-besiedelter chronischer Wunden.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Einführung 2.1 Die Haut des Menschen 2.1.1 Aufbau der Haut 2.1.1.1 Epidermis 2.1.1.2 Dermis 2.1.1.3 Subkutis 2.2 Die Haut der Maus 2.2.1 Aufbau und Vergleich der Haut von Mensch und Maus 2.3 Grundlagen der humanen Wundheilung 2.3.1 Physiologische Wundheilung 2.3.1.1 Inflammationsphase 2.3.1.2 Proliferationsphase 2.3.1.3 Remodeling 2.3.2 Diabetische Wundheilung 2.3.2.1 Chronische Wunden 2.4 Biofilme 2.4.1 Entstehung eines Biofilms 2.4.2 Herausforderungen durch Biofilm-Besiedlung 2.5 Behandlung Biofilm-besiedelter, chronischer Wunden 2.5.1 Topische Antiseptika zur Behandlung Biofilm-besiedelter chronischer Wunden 2.5.1.1 Polyvinylpyrrolidon-Iod(PVP-Iod) 2.5.1.2 LiposomalesPolyvinylpyrrolidon-Iod-Hydrogel(PVP-ILH) 2.6 Überblick translationaler Mausmodelle der Wundheilung 2.6.1 Das Rückenhautkammermodell (RHK) 2.6.2 Leipziger Rückenhautkammer und Modifikation für diabetische Mäuse 2.6.3 Vorversuche mit dem Leipziger Rückenhautkammermodell 3 Aufgabenstellung 4 Materialien und Methoden 4.1 Materialien 4.1.1 Chemikalien 4.1.2 Medikamente 4.1.3 Antikörper für die Immunhistochemie 4.1.4 Verwendetes ELISA-Kit zur Serum-ELISA 4.1.5 Geräte und sonstige Materialien 4.1.6 Programme 4.1.7 Versuchstiere 4.2 Methoden 4.2.1 Studienaufbau 4.2.2 Implantation der Rückenhautkammer (RHK) 4.2.3 Intravital-Mikroskopie 4.2.4 Histologie 4.2.4.1 EinbettungundSchnittederGewebeproben 4.2.4.2 Hämatoxylin-Eisen-Färbung(HE-Färbung) 4.2.5 Immunhistochemie 4.2.6 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) 4.2.7 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 4.2.8 Wundgrößenmessung 4.2.9 Auswertung der Immunhistochemie 4.2.10 Randomisierung der Versuchsgruppen mittels Random Group Generator 4.3 Statistische Auswertung 5 Ergebnisse 5.1 In – vivo - Ergebnisse 5.1.1 Gewichtsverlauf 5.1.2 Blutzuckerkontrollen 5.1.3 Wundgrößenmessungen 5.2 In – vitro - Ergebnisse 5.2.1 Histologie mit HE-Färbung 5.2.2 Immunhistochemie 5.2.3 FISH - Analyse 5.2.4 Serum-ELISA 6 Diskussion 6.1 Blutzuckerspiegel der Versuchstiere 6.2 Gewichtsverlust während des Versuchszeitraums 6.3 Einfluss von PVP-I und PVP-ILH auf die Wundgrößenreduktion 6.4 Einfluss von PVP-I und PVP- ILH auf die Gewebeinflammation (CD45) 6.5 Effekt von PVP-I und PVP- ILH auf die Neoangiogenese (CD31) 6.6 Einfluss von PVP-I und PVP-ILH auf den EZM- und Kollagenabbau (MMP-9) 6.7 Effekt von PVP-I- und PVP-ILH auf die Fibrogenese (α-SMA) 6.8 Einfluss der topischen PVP-I- und PVP-ILH-Behandlung auf die IL - 1α – Konzentration im murinen Serum 6.9 Effekt von PVP-I und PVP-ILH auf die Biofilmeradikation 6.10 Mögliche klinische Bedeutung der Ergebnisse für die diabetische Wundheilung 7 Zusammenfassung 8 Literatur 9 Anlagen 9.1 Abbildungsverzeichnis 9.2 Tabellenverzeichnis 9.3 Lebenslauf 9.4 Publikationen 9.5 Danksagung 10 Eigenständigkeitserklärung

Background: Pyoderma gangrenosum after cardiac surgery is a rare, noninfectious ulcerating skin disease mimicking sternal wound infection. Methods: A systematic search of literature for pyoderma gangrenosum complicating cases of cardiac surgerywas conducted between September 1985 and September 2020 on PubMed and Cochrane databases. A systematic review and detailed overview of clinical presentation, diagnostic, treatment, and outcome is provided. Results: A total of 15 studies enclosing 15 patients suffering from pyoderma gangrenosum following cardiac surgery were identified. Onset of symptoms was observed after a median of 5 days. Patients were predominantly male (81.3%) with a median age of 64 years. Typical clinical presentation mimicked sternal site infection, mainly by means of mediastinitis. Specific signs were rapid progression, erythematous to violaceous color of the wound border, accompanied by unspecific symptoms including fever, malaise, and severe pain. Additionally, pathergy (development of ulcers at the sites of minor cutaneous trauma) was reported frequently. Biopsy is mandatory with a cutaneous neutrophilic inflammation confirming the diagnosis. Initial treatment mostly (75.0% of reported cases) was misled, addressing suspicion of surgical site infection. After correct diagnosis, the treatment was switched to an immunosuppressive therapy. Full sternal wound closure took between 5 weeks and 5 months. Reported case mortality was 12.5% in actually low-risk surgeries. Conclusion: Despite pyoderma gangrenosum has typical signs, it remains an exclusion diagnosis. The treatment is completely opposite to the main differential diagnosis —the typical surgical site infection. Knowledge about diagnosis and treatment is essential in the context of avoiding fatal mistreatment.