Magíster en Bioquímica área de especialización en Bioquímica de Proteínas Recombinantes / Memoria de título de bioquímico / Las proteínas psicrófilas resultan muy útiles a nivel industrial pues permiten un ahorro de energía por presentar una alta actividad específica a bajas temperaturas en comparación con sus homólogas mesófilas (activas a temperaturas moderadas). En esta tesis se utilizó la enzima Xilanasa L, proveniente de bacterias psicrófilas de origen marino antártico, la cual es activa a bajas temperaturas. Las xilanasas son muy utilizadas en la industria, especialmente en el procesamiento del papel y degradación de fibras vegetales. La ventaja de las enzimas psicrófilas es que poseen una eficiencia catalítica aumentada, producto de adaptaciones que han tenido que desarrollar para superar las bajas temperaturas, las cuales inhiben al común de las enzimas mesófilas. Todas las enzimas adaptadas al frío encontradas en la naturaleza tienen el inconveniente de tener su estructura molecular demasiado flexible, lo que provoca una perdida de su conformación a moderadas y altas temperaturas, por ende pérdida de actividad. A través de técnicas de ingeniería de proteínas es posible obtener una variante más termoestable al rediseñar la estructura para ganar rigidez, pero sin disminuir su actividad a bajas temperaturas. Para lograr esto, se usó el análisis de dinámica molecular y el diseño racional para la elección de los sitios a mutar dentro del dominio catalítico de acuerdo al movimiento de cada residuo y así obtener una enzima con las características deseadas. Mediante mutagénesis por saturación, se generaron mutantes simples, obteniendose bibliotecas de 176 clones para cada aminoácido seleccionado. Se escogieron los clones más termoestables de cada biblioteca luego de una búsqueda (screening) rápida mediante ensayos enzimáticos. Se obtuvo una nueva xilanasa, llamada “DM1”, la cual resultó ser una proteína truncada. Ésta nueva xilanasa se caracterizó bioquímicamente y se comparó con la enzima templado. Se determinó que la enzima templado posee 752 residuos aminoacídicos, con una masa total de 83.15 kDa. Se alcanzó la temperatura óptima a los 41°C, y un pH óptimo de 9.2. Los parámetros cinéticos calculados por el método de Lineweaver-Burk fueron una constante de afinidad (Km) de 2.003 mg/mL y una Vmax de 0.100 . La Xilanasa DM1 posee 638 residuos aminoacídicos con una masa de 70.42 kDa, una temperatura óptima de 41°C y un pH óptimo de 6.3. Esta enzima posee una Km de 0.980 mg/mL y la Vmax fue 0.063 . La Xilanasa DM1 mejoró en 5°C su termoestabilidad frente a un shock térmico de 7 min. Las razones del aumento de la termoestabilidad en esta nueva variante de Xilanasa L no están claras pero podemos especular sobre esto. Para entender el efecto de la deleción del extremo C-terminal es necesario un modelamiento de la estructura completa de la enzima DM1. Esta nueva variante podría ser un primer paso para continuar la mejora de la xilanasa psicrófila. / The psychrophilic enzymes are very useful in the industry because they allow energy savings by its higher specific activity at low temperatures in comparison with their mesophilic homologues (active at moderate temperatures). In this thesis we used the Antarctic sea water Xylanase L which is active in low temperatures. Xylanases are very important, especially in the paper industry and degradation process of vegetable fibers. The advantage of the psychrophilic enzymes is that they have an increasing catalytic efficiency because they have developed strategies to overcome the low temperatures which inhibit the reactions catalyzed by mesophilic enzymes. All cold-adapted enzymes found in nature have the disadvantage of their high structural flexibility which causes a loss of their structural conformation at moderate to high temperatures, losing their catalytic activity. Through protein engineering we can redesign the enzyme structure in order to decrease the flexibility without a loss of low-temperature activity. We used molecular dynamics analysis and rational design to choose the residues for mutagenesis in the catalytic domain according to their movement. The chosen method was saturation mutagenesis through single mutant generation. We obtained 176 clones for each library. We choose the ones that show a higher thermostability in the enzymatic screening. We produced a new xylanase called “DM1”, which is a truncated protein. We did a biochemical characterization and compare it with the template enzyme. We determinated that the template enzyme had 752 residues, with a theoretical mass of 83.15 kDa. Its optimal temperature and pH was 41°C and 9.2, respectively. The kinetic constants obtained using Lineweaver-Burk method were Km=2.003 mg/mL and Vmax=0.100 . The Xylanase DM1 had 638 residues with a theoretical mass of 70.42 kDa, an optimal temperature of 41°C and an optimal pH of 6.3. This enzyme have a Km=0.980 mg/mL and a Vmax=0.063 . The Xylanase DM1 increased their thermostability in 5°C in a 7 minutes thermal shock. Altough the cause of the increase of thermostability of this new Xylanase L are not very clear, we can speculate about that. In order to understand the effects of the deletion of the C-terminal, is necessary a modeling of the complete structure of the DM1 enzyme. This new variant could be the first step of the improvement of the psychrophilic xylanase.

Ingeniero Civil en Biotecnología / Como una alternativa al uso de combustibles fósiles líquidos se propone utilizar bioetanol, con lo que se obtendría una reducción de los problemas asociados a la quema de los primeros. Bioetanol es un biocombustibles renovable que produce menos dióxido de carbono. Su producción es limitada por temas económicos, ya que sus costos no compiten con los combustibles convencionales. Dentro del proceso productivo de bioetanol de segunda generación, la etapa de hidrólisis de la biomasa es una de las asociadas a mayores costos, lo que repercute directamente en los mayores precios que alcanzan los biocombustibles de este tipo. En este documento se presenta un estudio realizado sobre xilanasas de origen fúngico. Estas enzimas intervienen en la hidrólisis del material lignocelulósico, degradando la cadena principal del xilano, que es el constituyente más abundante de la hemicelulosa y que dificulta el acceso de otras enzimas a la celulosa. La búsqueda de xilanasas se realizó en el contexto del proyecto FONDECYT 1121088, en que se busca identificar enzimas auxiliares que intervienen en la hidrólisis de la lignocelulosa, para generar mezclas celulolíticas mejoradas. El objetivo general del trabajo consistió en identificar xilanasas producidas por los hongos Trametes versicolor y Gloeophyllum trabeum, para evaluar su desempeño en la hidrólisis de paja de trigo. Se estudió las enzimas a través de dos enfoques: en el primero se clono los genes que codifican la información de las xilanasas y se estudió propiedades derivadas de la secuencia predicha para cada una; adicionalmente se realizó un estudio de las proteínas, purificándolas parcialmente desde cultivos de los hongos, así se evaluó la capacidad de hidrólisis de xilano y paja de trigo pre-tratada que tiene cada xilanasa. Se comprobó la expresión de xilanasas por ambas especies fúngicas al suplementar cultivos líquidos de paja de trigo pre-tratada 1% (p/v). Específicamente, se identificó dos xilanasas de G. trabeum: GTXYL1 y GTXYL2, y una de T. versciolor: TVXYL1. Se secuenció el gen que codifica para la xilanasa GTXYL1. Utilizando herramientas bioinformáticas se predijo un punto isoeléctrico de 4,57, un peso molecular de 37,9[kDa] y la presencia de una secuencia señal de exportación en el extremo amino y un dominio de la familia 10 de las glicosil hidrolasas. En el caso de T. versicolor se logró identificar tres grupos de fracciones con actividad xilanasa por cromatografía de intercambio aniónico. Por otro lado, a través de esta estrategia se separó la xilanasa GTXYL1 de G. trabeum. Se logró enriquecer 16,8 veces la actividad xilanasa, con una recuperación del 39% de la actividad del cultivo. En ensayos de hidrólisis de paja de trigo se detectó la liberación de xilosa por las muestras provenientes del medio extracelulares de los hongos, con esto se concluye que las xilanasas de estos hongos son capaces de degradar la hemicelulosa presente en biomasa lignocelulósica. Se recomienda seguir los estudios, clonando el gen obtenido de GTXYL1 en un vector de expresión para producir la enzima de forma recombinante y, de este modo, caracterizarla y evaluar su capacidad de hidrólisis sobre compuestos lignocelulósicos.

[ES] Las plantas están emergiendo como una alternativa atractiva a los sistemas convencionales de producción heteróloga, como bacterias, cultivos celulares de mamíferos, levaduras u hongos, para la síntesis de productos de alto valor, como metabolitos secundarios y proteínas. La demanda de estos productos a menudo se ve limitada por la capacidad de producción y los costos asociados. Sin embargo, utilizar las plantas como plataformas de producción ofrece ventajas en términos de accesibilidad económica, sostenibilidad, escalabilidad y la ausencia de patógenos humanos y de animales, lo que las convierte en una opción cada vez más atractiva. A pesar de las limitaciones en la capacidad de carga, la expresión génica transitoria utilizando vectores virales proporciona un método eficiente y reproducible para la producción de proteínas recombinantes en plantas, a diferencia de la transformación estable, que requiere más mano de obra y tiempo. Los vectores derivados del virus del mosaico del tabaco (TMV), particularmente aquellos en los que el gen de la proteína de la cubierta viral (CP) se reemplaza principalmente por el gen de interés, son clásicos en la biotecnología vegetal y se utilizan con frecuencia para la producción a gran escala de proteínas recombinantes. En este trabajo, nuestro primer objetivo fue optimizar un vector de TMV para mejorar la producción. La fusión traduccional del extremo amino-terminal de la CP del TMV con la proteína recombinante de interés mostró un aumento en la acumulación de la proteína verde fluorescente, interferón alfa-2a y un nanobody contra la proteína Spike del SARS-CoV-2 en hojas de Nicotiana benthamiana. La inserción de un sitio de clivaje específico, basado en las proteasas de inclusión nuclear (NIaPro) de dos potyvirus, junto con la expresión de las proteasas correspondientes, además de la producción de la proteína recombinante madura, aumentó aún más la acumulación de las proteínas recombinantes mencionadas anteriormente. En segundo lugar, nuestro objetivo fue establecer estrategias para producir proteínas recombinantes de interés industrial y farmacéutico en N. benthamiana utilizando un vector de TMV. Logramos producir grandes cantidades de una xilanasa termofílica, activa en condiciones extremas de temperatura y pH alcalino, en N. benthamiana utilizando un vector de TMV. La enzima que se acumuló rápidamente en los tejidos de la planta se dirigió al apoplasto, lo que facilitó enormemente la purificación y evitó cualquier efecto adverso en el crecimiento de la planta. Se demostró que esta enzima producida en planta es útil para la producción de xilooligosacáridos probióticos. También produjimos grandes cantidades de una glucosa oxidasa (GOX) modificada en hojas de N. benthamiana utilizando un vector de TMV. La GOX producida en planta, que también se purificó fácilmente a partir de fluidos apoplásticos, exhibió potentes propiedades antimicrobianas contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli. / [CA] Les plantes están emergint com una alternativa atractiva als sistemes convencionals de producció heteròloga, com ara bacteries, cultius cel·lulars de mamífers, llevats o fongs, per a la síntesi de productes d'alt valor, com son metabòlits secundaris i proteïnes d'interés industrial i farmacéutic. La demanda d'aquests productes sovint es veu limitada per la capacitat de producció i els costos associats. No obstant això, utilitzar les plantes com a plataformes de producció ofereix avantatges en termes d'accessibilitat econòmica, sostenibilitat, escalabilitat i l'absència de patògens humans i animals, la qual cosa les converteix en una opció cada vegada més atractiva. Malgrat les limitacions en la capacitat de càrrega, l'expressió gènica transitoria mitjançant vectors virals proporciona un mètode eficient i reproducible per a la producció de proteïnes recombinants en plantes, a diferència de la transformació estable, que requereix més mà d'obra i temps. Els vectors derivats del virus del mosaic del tabac (TMV), particularment aquells en els quals el gen de la proteïna de la coberta viral (CP) és principalment reemplaçat pel gen d'interès, són clàssics en la biotecnologia vegetal i s'utilitzen sovint per a la producció a gran escala de proteïnes recombinants. En aquest treball, el nostre primer objectiu va ser optimitzar un vector de TMV per a millorar la producció. La fusió traduccional de l'extrem amino-terminal de la CP del TMV amb la proteïna recombinant d'interès va mostrar un augment en l'acumulació de la proteïna verda fluorescent, interferó alfa-2a i un nanobody contra la proteïna Spike del SARS-CoV-2 en fulles de Nicotiana benthamiana. La inserció d'un lloc de tall específic, basat en les proteases d'inclusió nuclear (NIaPro) de dos potivirus, juntament amb l'expressió de les proteases corresponents, a més de la producció de la proteïna recombinant madura, va augmentar encara més l'acumulació de les proteïnes recombinants esmentades anteriorment. En segon lloc, el nostre objectiu va ser establir estratègies per a produir proteïnes recombinants d'interés industrial i farmacèutic en N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. Vam aconseguir produir grans quantitats d'una xilanasa termofílica, activa en condicions extremes de temperatura i pH alcalí, en N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. El enzim que es va acumular ràpidament en els teixits de la planta es va dirigir a l'apoplast, la qual cosa va facilitar enormement la purificació i va evitar qualsevol efecte advers en el creixement de la planta. Es va demostrar que aquesta enzima produïda en planta és útil per a la producció de xilooligosacàrids probiòtics. També vam produir grans quantitats d'una glucosa oxidasa (GOX) modificada en fulles de N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. La GOX produïda en planta, que també es va purificar fàcilment a partir de fluids apoplàstics, va exhibir potents propietats antimicrobianes contra Staphylococcus aureus i Escherichia coli. / [EN] Plants are emerging as an attractive alternative to conventional heterologous production systems, including bacteria, mammalian cell cultures, yeast, or fungi, for the synthesis of high-value products, such as secondary metabolites and proteins. The demand for these products is often limited by production capacity and associated costs. However, using plants as production platforms offers advantages in terms of affordability, sustainability, scalability, and the absence of human and livestock pathogens, making them an increasingly appealing choice. Despite limitations in cargo capacity, transient gene expression using viral vectors provides an efficient and reproducible method for producing recombinant proteins in plants, unlike stable transformation, which is more labor- intensive and time-consuming. Vectors derived from tobacco mosaic virus (TMV), particularly those in which the viral coat protein (CP) gene is mostly replaced with the gene of interest, are classic in plant biotechnology and frequently use for large-scale production of recombinant proteins. In this work, we first aimed to optimize a TMV vector to improve production. Translational fusion of the amino- terminal end of TMV CP to the recombinant protein of interest led to increased accumulation of the green fluorescent protein, interferon alfa-2a and a nanobody against the Spike protein of SARS-CoV-2 in Nicotiana benthamiana leaves. Insertion of a specific cleavage site, based on the nuclear inclusion a proteases (NIaPro) form two potyviruses, along expression of the cognate proteases led to, in addition to production of the mature recombinant protein, a further increase in the accumulation of the aforementioned recombinant proteins. Second, we aimed to set up strategies to produce recombinant proteins of industrial and pharmaceutical interest in N. benthamiana using a TMV vector. We successfully produced large amounts of a thermophilic xylanase, active under extreme temperature and alkaline pH conditions, in N.benthamiana using a TMV vector. The enzyme that accumulated rapidly in plant tissues was targeted the apoplast, which enormously facilitated purification, and avoided any adverse effect on plant growth. This plant-made enzyme was shown to be useful for the production of probiotic xylooligosaccharides. We also produced large amounts of an engineered glucose oxidase (GOX) in N. benthamiana leaves using a TMV vector. The plant-made GOX that was also easily purified from apoplastic fluids exhibited potent antimicrobial properties against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. / This work was supported Generalitat Valenciana, grant INNEST/2021/7 from Agència Valenciana de la Innovació, and by grant PID2020-114691RB-I00 from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación, through the Agencia Estatal de Investigación (co-financed European Regional Development Fund), and by the Bio Based Industries Joint Undertaking, under the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program (Project WOODZYMES, Grant Agreement H2020-BBI- JU-792070). M.N.-S. is the recipient of a predoctoral contract from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (PRE2018-084771). / Nicolau Sanus, M. (2023). Production of Recombinant Proteins with Pharmaceutical and Industrial Applications in Plants Using a Tobacco Mosaic Virus-Derived Vector [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/200381