Determina la patogenicidad de una cepa motil de Y. ruckeri procedente de Huaraz y caracterizar histológicamente las lesiones halladas en diversos órganos de alevines de trucha arcoíris. Para ello, se utilizó 100 alevines con un peso promedio de 7.25 g, divididos en 5 grupos de 20 individuos (cuatro experimentales y un control), mantenidos en estanques de 30 litros. Los peces fueron inoculados por vía intramuscular 0,1 ml de la cepa de Y. ruckeri a diversas concentraciones: 1x104 /ml para el grupo 1 (G1), 4x104 /ml para el grupo 2 (G2), 1x108 /ml para el grupo 3 (G3), 4x108 /ml para el grupo 4 (G4) y el grupo control con PBS. Se realizó un monitoreo diario por 12 días, registrándose signos clínicos, lesiones externas e internas (en muertos), morbilidad y mortalidad. Los peces moribundos se anestesiaron con eugenol (3 ml/l), luego se les realizó corte medular y posterior necropsia según Meyers (2009). Para comprobar que los peces sólo eran afectados por Y. ruckeri inoculada, se realizó el aislamiento bacteriano de muestras de bazo y riñón, los cuales fueron cultivados en agar tripticasa de soya por 24-48 horas a 25°C, observándose crecimiento de colonias bacterianas con características bioquímicas a Y. ruckeri, siendo confirmadas posteriormente por PCR convencional. Así mismo, se colectaron muestras de intestino, bazo, riñón, hígado, músculo y branquias para el análisis histopatológico. Todos los peces inoculados con Y. ruckeri presentaron signos y lesiones compatibles con yersiniosis; registrándose inapetencia (95%) y melanosis (76%) como los signos más frecuentes, los cuales aparecieron a las 12 horas post inoculación en los grupos G3 y G4, y al 3° día post inoculación (dpi) para los grupos G1 y G2. Entre las lesiones más importantes se observó esplenomegalia (84%), contenido mucoso en intestino (80%) y congestión intestinal (60%). Adicionalmente se determinó una mortalidad de 100% para los grupos G3 y G4, la cual empezó al 2° dpi para ambos; y mortalidades de 65 y 60% para los grupos G1 y G2, respectivamente, las cuales iniciaron al 7° dpi para ambos. A nivel histopatológico, los órganos más afectados fueron intestino con: evidente necrosis, hiperplasia de enterocitos y células mucosas, y presencia de bacterias; el bazo presentaba: congestión, presencia de melanomacrófagos y bacterias, extravasación de glóbulos rojos y disminución linfoide; y el músculo con: necrosis, y presencia de bacterias y melanomacrófagos. En conclusión, la cepa mótil de Yersinia ruckeri procedente de Huaraz es patógena, produciendo mortalidad y diversas lesiones en tejidos de truchas arcoíris según su concentración en condiciones experimentales. Las concentraciones de 1x108 y 4x108 de Y. ruckeri produjeron los más altos índices de patogenicidad; sin embrago, concentraciones tan bajas, como 1x104 y 4x104 de Y. ruckeri, confirman la patogenicidad de esta cepa bacteriana; ya que ocasionaron mortalidades y lesiones anátomo-patológicas significativas en truchas arcoíris, tal como se describen en infecciones naturales. / Tesis

Yersinia pseudotuberculosis is a foodborne pathogen that is the ancestral strain to Yersinia pestis, the causative agent of Plague. Y. pseudotuberculosis invades a host through the intestinal epithelium. The bacteria resist mucosal innate immune defenses including antimicrobial chemokines and phagocytic cells, and replicate in local lymph nodes. They cause Tuberculosis-like symptoms, including necrosis of local tissue and granuloma formation. Like all bacteria, Y. pseudotuberculosis has a net negative charge, which contributes to its susceptibility to some cationic antimicrobial peptides. Y. pseudotuberculosis is able to reduce this negative charge by adding 4-amino-4-deoxy-L-arabinose (L-Ara4N) to the lipid A portion of lipopolysaccharide. The production and addition of the L-Ara4N is coded for by the pmrHFIJKLM (pmrF) operon. A previous study has shown that the Y. pseudotuberculosis pmrF operon is important for resistance against polymyxin, but is not important for virulence in mice. Several previous reports have shown a strong influence of growth temperature on resistance to antimicrobial peptides and pmrF expression in pathogenic Yersinia species, but these studies also suggest significant variability between species, and even between strains of individual species. In particular, the regulation of the Y. pseudotuberculosis pmrF operon and its effect on bacterial interactions with mucosa-associated antimicrobial chemokines and neutrophils is not understood. In these studies, we investigated the environmental influences on pmrF expression in Y. pseudotuberculosis. We found that the promoter activity of the pmrHFIJKLM operon is increased at lower temperatures (21ºC) and in the presence of human serum. A ΔpmrI mutant strain of Y. pseudotuberculosis defective for addition of L-Ara4N was found to be more susceptible to killing by the antimicrobial chemokine CCL28 compared to wild-type. This suggests that this gene is important in the bacterial defense against antimicrobial chemokines. However, when the ΔpmrI mutant strain was exposed to human neutrophils, there was a decrease in phagocytosis as compared to wild-type bacteria. Our results suggest that the regulation of L-Ara4N modifications in Yersinia is more complex than previously appreciated and varies between species. Addition of L-Ara4N to Y. pseudotuberculosis appears to enhance resistance to some antimicrobial peptides like CCL28 and promote greater phagocytic engulfment by neutrophils. These opposing effects may partly explain why there is no net apparent survival defect in mutants lacking the pmrF operon during infection.

In dieser Arbeit wurden zwei Aspekte der Yersinia β-Laktamasen bearbeitet: (1) Charakterisierung der β-Laktamasen hinsichtlich β-Laktam-Antibiotikaresistenz, Sekretion und Thermostabilität. (2) Untersuchung der Sekretionsfähigkeit von verschiedenen thermostabilen β Laktamasen über das Yersinia T3SS. Im ersten Teil wurden β Laktamase-Deletionsmutanten im Y. enterocolitica Serotyp O:8 Stamm WA-314 hergestellt, um den Einfluss der chromosomalen β Laktamasen auf die in vitro-Resistenz zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass WA-314 konstitutiv BlaA produziert und BlaA somit – unter nicht-induzierbaren Bedingungen – der dominante Faktor in der in vitro-Resistenz gegenüber Penicillinen mit erweitertem Wirkungsspektrum (z.B. Ampicillin) und Cephalosporinen der 1. Generation (z.B. Cefazolin) ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die zweite chromosomale β Laktamase AmpC (BlaB) unter Zugabe von subinhibitorischen Konzentrationen von Imipenem stark induziert wird. Keine der β Laktamasen ist in der Lage, in vitro-Resistenz gegenüber Carbapenemen und Monobactamen zu vermitteln. Die Konstruktion und Bestimmung der in vitro Antibiotika-Empfindlichkeit der β Laktamase-Deletionsmutanten dient als Grundlage für nachfolgende Untersuchungen im Mausinfektionsmodell. Weiterhin wurden die Transporteigenschaften beider β Laktamasen untersucht. In Gram-negativen Bakterien sind reife β Laktamasen im Periplasma lokalisiert und müssen somit nach der Synthese im Cytosol über die Cytoplasmamembran transportiert werden. Bis auf drei Ausnahmen (β Laktamasen aus Mycobacterium smegmatis, M. tuberculosis und Stenotrophomonas maltophila) sind bisher nur Sec-abhängige β Laktamasen beschrieben worden. Mittels Fusionsproteinen bestehend aus β Laktamase-Signalpeptiden und GFP konnte in dieser Arbeit eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei Yersinia BlaA um ein Tat-Substrat handelt, bei Yersinia AmpC hingegen um ein Sec-Substrat. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal eine Tat-abhängige β Laktamase bei einer Bakterienart aus der Familie der Enterobacteriaceae nachgewiesen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die β Laktamase BlaA nicht diffus im Periplasma, sondern auf bestimmte Bereiche im Periplasma lokalisiert verteilt ist. Allerdings konnte die Art der Lokalisierung bisher nicht genau spezifiziert werden. Die cytosolische Faltung und die Tat-abhängige Translokation von BlaA lassen vermuten, dass eine besondere Thermostabilität von BlaA vorliegt. Deshalb wurde das BlaA-Enzym hinsichtlich seiner Thermostabilität und temperaturabhängigen enzymatischen Aktivität untersucht. Im Vergleich zur E. coli β Laktamase TEM-1 und der hitzestabilen TEM-1-Variante MEGA zeigte BlaA eine erhöhte Thermostabilität und einen starken Anstieg der Aktivität in einem Temperaturbereich zwischen 30 °C und 45 °C. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob die charakterisierten Yersinia β Laktamasen als Reporterkonstrukte zur Untersuchung des Typ III Sekretionssystems (T3SS) geeignet sind. Y. enterocolitica besitzt ein pYV Virulenzplasmid, auf dem der vollständige Satz der Gene für das Ysc-T3SS und die Effektor-Yops (Yersinia outer protein) lokalisiert sind. Injektion der Yops in eukaryotische Zielzellen ermöglicht das extrazelluläre Überleben der Yersinien im Wirtsorganismus. Bei YopE handelt es sich um ein gut charakterisiertes Effektor-Yop, dessen N Terminus fusioniert an den reifen Teil der β Laktamase TEM-1 bereits vielfach als Reporterkonstrukt eingesetzt wurde. Unter Verwendung des fluoreszierenden β Laktamase-Substrats CCF4-AM kann die Translokation von YopEi-TEM-1 in Zielzellen in Zellkultur-Experimenten und im Mausinfektionsmodell visualisiert werden. In dieser Arbeit sollte deshalb die T3SS-Sekretionsfähigkeit von YopE-β Laktamase-Fusionsproteinen in Abhängigkeit von der „Schmelztemperatur“ (temperaturabhängige Stabilität, TM) untersucht werden. Yop-Substrate werden im ungefalteten Zustand (YscN wirkt dabei vermutlich als ATP-abhängige „Unfoldase“) über das Ysc-„Injektisom“ transloziert. YopEi-TEM-1 wird effizient sekretiert und transloziert (TM (TEM-1) = 50,8 °C). YopE-Fusionsproteine mit thermostabilen TEM-1 Varianten, YopEi-RLT bzw. YopEi-MEGA (TM (RLT) = 60,4 °C; TM (MEGA) = 69,2 °C) werden hingegen nur schwach bzw. nicht sekretiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Sec-abhängige β Laktamase AmpC als YopE-Fusionsprotein (YopEi-AmpC) effizient T3SS-abhängig sekretiert und transloziert werden kann; das native Tat-Substrat BlaA (YopEi-BlaA) kann jedoch weder sekretiert noch transloziert wird. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die ATPase YscN nicht in der Lage ist, BlaA und die thermostabilen TEM-1-Varianten zu entfalten und über das T3SS zu sekretieren und zu translozieren. RLT und MEGA können hingegen mithilfe ihrer nativen Signalsequenz über das Sec-System (und somit im ungefalteten Zustand) transloziert werden. / In this work, two aspects concerning the Yersinia β lactamases have been processed: (1) Characterization of the β lactamases in regard of β lactam antibiotic resistance, secretion and thermostability. (2) Analysis of the secretability of different thermostable β lactamases via the Yersinia T3SS. In the first part of this work we described the β lactam sensitivity pattern of the highly mouse pathogenic Y. enterocolitica strain WA 314 by creating a set of β lactamase deletion mutants and their subsequent characterization in vitro. In accordance to previous studies on biovar 1B, serovar O:8 strains, WA 314 produces both enzymes BlaA and AmpC (BlaB) and latter one is inducible using subinhibitory concentrations of imipenem. BlaA is dominant in providing in vitro-resistance towards extended-spectrum β lactams (e.g. ampicillin) and 1st generation cephalosporins (e.g. cefazolin). None of the β lactamases is able to mediate in vitro-resistance towards carbapenems and monobactams. The construction of β lactamase deletion mutants and their in vitro-characterization is the basis for their subsequent analysis within a murine infection model. Furthermore, we investigated the export mechanism of both β lactamases. In Gram-negative bacteria β lactamases are localized in the periplasmic space to be able to cleave the amide bond of the β lactam ring resulting in inactivation of the antibiotic. Proteins are translocated across the inner membrane either via the general secretory pathway (Sec system) or via the twin arginine pathway (Tat system). To date, only three β lactamases have been described as Tat-dependently translocated namely BlaC from Mycobacterium tuberculosis, BlaS from M. smegmatis and L2 from the plant pathogen Stenotrophomonas maltophila. In silico studies and experimental approaches lead to the assumption that the majority of β lactamases is translocated in a Sec-dependent manner. Analysis of β lactamase signal sequence-GFP fusion proteins revealed that Yersinia AmpC is a Sec-substrate whereas Yersinia BlaA is a Tat-substrate. Thus, BlaA of Y. enterocolitica is the first reported β lactamase within the family of Enterobacteriaceae which is secreted by the Tat system. Interestingly, closely related blaA genes are widely distributed within all Y. enterocolitica biovars and several environmental Yersinia species. It is generally accepted that Tat-dependent substrates rapidly fold in the cytoplasma. To compare the BlaA protein stability with that of the Sec-dependent β-lactamases of the TEM-1 family we determined thermal unfolding transitions and temperature dependent enzymatic activities. In contrast to TEM-1 β lactamase, BlaA shows an entire different activity profile with steep increase of activity in the temperature range of 30 °C to 45 °C and steep decrease between 50 °C to 60 °C. In the second part, the Yersinia β lactamases AmpC and BlaA characterized in this work were tested for suitablility as reporter constructs for analyzing the Ysc-T3SS. Y. enterocolitica harbors a pYV virulence plasmid which encodes genes for components of the Ysc-T3SS secretion machinery and the effector Yops (Yersinia outer protein). Injection of Yops into the eukaryotic host cell enables the extracellular survival of Yersinia within the host organism. YopE is a well described effector Yop and YopE-β lactamase (TEM-1) fusion proteins have been successfully applied to analyze translocation of YopE in cell culture experiments and in the murine mouse infection model by using the fluorescent β lactamase substrate CCF4-AM. In this work, we aimed to analyze the T3SS-dependent secretability of YopE-β-lactamase fusion proteins in dependency on the melting temperature (temperature dependent stability, TM). It has been described that Yop substrates are translocated in an unfolded conformation via the Ysc-“injectisom” (YscN has been discussed as an ATP-dependent unfoldase). YopEi-TEM-1 is efficiently secreted and translocated (TM (TEM-1) = 50.8 °C). However, YopE fusion proteins with heat stable TEM-1 variants, YopEi-RLT and YopEi-MEGA (TM (RLT) = 60.4 °C; TM (MEGA) = 69.2 °C), were weakly secreted or secretion is completely abolished, respectively. Furthermore we could show that a YopE fusion protein with the Sec-dependent β lactamase AmpC (YopEi-AmpC) is efficiently secreted and translocated via the T3SS. In contrast, the Tat-dependent β lactamase BlaA (YopEi-BlaA) can neither be secreted nor translocated T3SS-dependently. A putative explanation for that observation would be that the ATPase YscN is unable to unfold BlaA and the heat stable TEM-1 variants and therefore secretion and translocation is prevented. Interestingly, native RLT and MEGA β lactamases can be translocated in an unfolded conformation via the Sec system.

Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2009

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2009.

No description available.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Univ., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. med. vet. Bern (kein Austausch). / Literaturverz.

Techn. Univ., Diss., 2010--München.

Tierärztliche Hochsch., Diss., 2005--Hannover.