Die Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein Modellorganismus, der nach der Entdeckung von zwei Photorezeptoren, den Kanalrhodopsinen, eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung der Optogenetik spielte. Kanalrhodopsine sind lichtinduzierte Ionenkanäle, die für das photoinduzierte Verhalten von Chlamydomonas verantwortlich sind. Aufgrund der Herausforderungen bei der gentechnischen Modifizierung in diesem Organismus konnte ihre Funktion in Phototaxis und photophober Reaktion bisher nicht umfassend untersucht werden.
In dieser Arbeit präsentiere ich eine CRISPR-Cas9-basierte Technik, die einen zielgerichteten Austausch einzelner Nukleotide in einem ausgewählten Gen in vivo ermöglicht. Hierfür wird gezielt ein DNA-Doppelstrangbruch innerhalb des Gens induziert und anschließend wieder durch Aktivierung des Homologie-gesteuerten Reparaturmechanismus der Alge behoben, bei dem eine ausgewählte Punktmutation integriert wird.
Diese Technik habe ich anschließend verwendet, um die Funktion der Kanalrhodopsine ChR1 und ChR2 in vivo aufzuklären. Dazu habe ich die codierenden Gene jeweils im Chlamydomonas Wildtyp-Stamm ausgeschaltet und Punktmutationen im verbleibenden Kanalrhodopsin eingeführt. Die so erzeugten Kanalmutanten weisen Veränderungen in ihrer Photozykluskinetik und Ionenselektivität auf, die das lichtabhängige Verhalten der Alge beeinflussen sollten.
Die Ergebnisse zeigten zum einen, dass sowohl ChR1 als auch ChR2 Photorezeptoren sind, die die Phototaxis steuern, und zum anderen, dass eine Erhöhung der ChR2-Expression nach Deletion von ChR1 die phototaktische Aktivität der Algen wiederherstellt. Darüber hinaus wiesen die mutierten Chlamydomonas-Stämme mit veränderter Photozykluskinetik und reduzierter Kalzium-Permeabilität eine fast 100-fache Verringerung der Photosensitivität, eine verminderte photophobische Reaktion und schnellere Lichtadaptation auf. Zudem führte die Umkehr der Selektivität vom Channelrhodopsin von Kationen zu Anionen zum kompletten Verlust der Photoreaktion der Algen. Nicht zuletzt konnte diese Studie die Bedeutung der Proton-Leitfähigkeit der Kanalrhodopsine für das photoinduzierte Verhalten von Chlamydomonas aufzeigen. / The green alga Chlamydomonas reinhardtii is a model organism that played a key role in the development of optogenetics, after discovery of two photoreceptors called channelrhodopsins. Channelrhodopsins are light-gated ion channels that are responsible for photo-induced behavior of Chlamydomonas.
Untill now, their functionality in algal photoresponses such as phototaxis and photophobic reaction has not been extensively studied, primarily due to the challenges connected to genetic editing in the organism.
In this work, I presented a CRISPR-Cas9-based technique allowing a targeted exchange of single nucleotides in a gene of interest in vivo. It is based on targeted induction of DNA double-stranded breaks in the gene and on subsequent engagement of homologous recombination to repair the damage and integrate a selected point mutation.
To elucidate the function of channelrhodopsins ChR1 and ChR2 in vivo, I created channelrhodopsin single knockouts in the wild-type Chlamydomonas strain and integrated point mutations in the remaining channelrhodopsin gene. The selected mutations affected photocycle kinetics and ion selectivity. It was shown that, first, both ChR1 and ChR2 are photoreceptors that mediate phototaxis and second, the upregulation of ChR2 upon the deletion of ChR1 rescues phototactic activity of the algae. Further, the mutant Chlamydomonas strains with altered photocycle kinetics and lower calcium permeability exhibited nearly 100-fold reduction of photosensitivity, a diminished photophobic reaction and faster light adaptation rates. Moreover, the conversion of channelrhodopsin selectivity to anions aborted algal photoresponse. In addition, the study highlighted the importance of proton conductance in the photo-induced behavior of Chlamydomonas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/28162 |
| Date | 13 October 2023 |
| Creators | Baidukova, Olga |
| Contributors | Hegemann, Peter, Kaufmann, Kerstin, Terashima, Mia |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY 4.0) Attribution 4.0 International, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ |
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