PCR und Fluoreszenz - DNA - Fragment - Analyse zum Nachweis einer monoklonalen B-Zell-Population zur Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome (CBCL) Der Nachweis einer monoklonalen B-Zell Population mittels PCR hat sich seit ca. zehn Jahren ergänzend zu Klinik und Histopathologie in der Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome etabliert. Zu diesem Zweck wurden Primer für die IgH Framework-Regionen (FR1, 2, 3), die Leader-Sequenz und für die JH-Region sequenziert. Alle Primervarianten führen zur Amplifikation der hochvariablen CDR-3 Region, welche für jede B-Zelle spezifisch ist. Die Kapillarelektrophorese mit fluoreszenzmarkierten PCR-Produkten an automatischen Sequenziergeräten (z. B. Genescan ABI Prism 310) ermöglicht eine exakte Größenbestimmung des jeweiligen Fragmentes und ist daher in diesem Zusammenhang die geeignetste Methode. Zunächst wurden alle relevanten Primer mit der Simulationssoftware Oligo hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften geprüft. Danach wurden ausgewählte Primer-Sets an 58 in Paraffin eingebetteten und an 5 Kryoproben von sicher diagnostizierten CBCL-Patienten getestet. Die fluoreszenzmarkierten Produkte wurden mit dem Sequenziergerät ABI Prism 310 analysiert. Die ungeschachtelte FR3/JH-PCR konnte nur in 30% und zusammen mit der halbgeschachtelten FR3/JH-PCR nur in 37% der Fälle klonale B-Zellen nachweisen. Die Detektionsrate erhöhte sich auf 54% unter Einbeziehung der geschachtelten FR1/JH-PCR und schließlich auf 60% mit einer zusätzlichen geschachtelten FR2/JH-PCR. Das Auftreten von Pseudoklonen (variierende Größe des klonalen Peaks bei Wiederholung der PCR) bei den geschachtelten PCR machte eine Prüfung auf Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unbedingt erforderlich. Die höchste Rate an Pseudoklonen zeigte die FR2/JH-PCR. Aufgrund der schlechten Qualität der IgH Leader-PCR konnten mit in Paraffin-eingebetteten Proben keine Amplifikate erzeugt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, daß gemeinsame Verwendung der in dieser Arbeit entwickelten PCR eine Sensitivitätssteigerung von 30% auf 60% ermöglichen. / Clonality detection in cutaneous B-cell lymphomas (CBCL) using immunoglobulin heavy chain gene PCR assays and fluorescence PCR-fragment analysis on automated DNA sequencer Detection of clonally expanded immunoglobulin heavy chain (Igh) gene rearrangements by PCR and subsequent electrophoresis is increasingly used in the diagnosis of cutaneous B-cell lymphomas (CBCL). To this end, primers for the three Igh framework regions (FR1,2, 3), the leader sequence and the Jh region are applied, all amplifying the highly variable IgH third complementary region (CDR3) Recently, fluorescence PCR-fragment analysis on automated DNA sequencers (GeneScan analysis, GSA), providing an exact sizing has been applied as appropriate seperation technique in this context. We have evaluated all Igh primers hitherto known by a PC primer analysis program. Then, fluorescently labeled products generated from DNAs of 58 paraffin embedded and 5 frozen lesional skin biopsies of confirmed CBCL cases using the primer sets selected, were analysed by GSA on the ABI 310 Prism instrument. Single round or seminested FR3/JH-PCR showed clonal B-cells only in 30 or 37% of cases, respectively. This fraction was increased to 54% including a nested FR1/JH-PCR, and, to 60% applying a supplementary nested FR2/JH-PCR. However false clonal results, indicated by peaks of varying sizes from repeated PCR, have been received by nested PCR, mostly by FR2/JH. Obviously due to their poor quality, the IgH leader-PCR has not yielded amplification products from paraffin-derived DNAs. Our data show that the FR3/JH-PCR only is not sufficient for detecting B-cell clonality in CBCL, but following inclusion of additional IgH-PCR, an increase of detection rate up to 60% is possible. A substantial number of cases still fail to show clonality.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/15675 |
| Date | 12 March 2004 |
| Creators | Marchwat, Maren |
| Contributors | Lukowsky, A., Neumann, C., Stein, H. |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité, Klinik für Dermatologie / Venerologie und Allergologie |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/octet-stream |
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