In der vorliegenden Arbeit werden die Immunglobulinsequenzen von primär kutanen B-Zell-Lymphomen untersucht und die Methoden der Mikromanipulation und Einzelzell-PCR erstmalig in der dermatologischen Forschung angewendet. Mutationsanalysen der Immunglobulingene von B-Lymphozyten können Auskunft darüber geben, in welchem Stadium ihrer Entwicklung sich die B-Zellen zum Zeitpunkt ihrer Untersuchung befinden, wodurch Rückschlüsse auf die Herkunft der Lymphomzellen möglich sind. Wir untersuchten insgesamt 106 B-Lymphozyten von zwei Patienten mit primär kutanem B-Zell-Lymphom, die in beiden Fällen aus mindestens zwei verschiedenen Biopsien gewonnen wurden. Die Sequenzanalyse konnte sowohl für das primär kutane Keimzentrumszell-Lymphom als auch für das großzellige B-Zell-Lymphom der unteren Extremität die Tumorzellen als reife, mutierte germinal center-B-Zellen oder deren Abkömmlinge identifizieren, was die histologische Beurteilung dieser Zellen als von Keimzentrumszellen abstammend unterstützt. Zumindest für das Keimzentrumszell-Lymphom des Patienten UK konnte nachgewiesen werden, daß die Zellen nach ihrer Transformation zu Tumorzellen noch zur Hypermutation befähigt waren. Eindeutige Indizien für eine antigenabhängige Verteilung der Mutationen gibt es - die derzeitigen Analyseverfahren (R/S-Ratio) nutzend - nicht, was aber die Rolle eines Antigens bei der Entstehung oder gar Progression des Tumorklons nicht ausschließt, wie in der Diskussion ausführlich erläutert wird. Anhand der vorliegenden Sequenzen konstruierte single chains (über einen linker gekoppelte variable Fragmente der H- und L-Kette) oder besser vollständige antigenbindende Fragmente (H- und L-variables Fragment plus den C1-Domänen) werden in Bindungsstudien die Frage der Spezifität und Affinität der Tumorantikörper beantworten helfen. Molekularbiologische Unterschiede zwischen beiden untersuchten Tumorentitäten bestehen zum einen in der deutlich höheren Mutationsfrequenz sowie dem Fehlen von intraklonaler Diversität bzw. andauernder Mutation des VH-Gens der Patientin IL mit dem großzelligen B-Zell-Lymphom der unteren Extremität. Es ist selbstverständlich notwendig, mehrere Fälle zu untersuchen, um einen molekularbiologischen Unterschied zwischen den Keimzentrumszell-Lymphomen und den großzelligen Lymphomen der unteren Extremität zu konstatieren und somit einen Beitrag für die Klassifikation primär kutaner B-Zell-Lymphome zu leisten.

Primär kutane Lymphome sind typische Krankheitsbilder in der Dermatologie. Obwohl diese Erkrankungen zu den seltenen Krankheiten zählen, sind sie jedoch von therapeutischem und wissenschaftlichen Interesse. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Klassifikation und Therapie primär kutaner Lymphome. Die 1997 veröffentlichte EORTC-Klassifikation wird mit ihren wichtigsten Entitäten erläutert. Die EORTC-Klassifikation geht auf spezifische Besonderheiten der primär kutanen Lymphome ein und orientiert sich an der guten Prognose dieser Erkrankungen. Therapeutische Strategien wie der Einsatz von für kutane Lymphome typische Behandlungsmethoden (PUVA, Exzision, Radiatio) als auch gentechnisch hergestellte Medikamente wie therapeutische Antikörper und Vakzinen werden erklärt. Der zweiten Teil der Habilitationsschrift konzentriert sich auf experimentelle Arbeiten zur molekularbiologischen Untersuchung von primär kutanen Lymphomen. Im Mittelpunkt steht die Methode der Mikromanipulation und Einzelzell-PCR. Für die Mykosis fungoides konnte gezeigt werden, daß im initialen Ekzemstadium nur wenige klonale maligne T-Zellen in der Probe nachzuweisen sind. Mit Zunahme des Infiltrates (Plaque) sind die malignen Zellen in der Epidermis oder gruppiert in der Dermis lokalisiert. Im Tumorstadium dominieren die malignen Zellen das dermale Infiltrat (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2000). Die Tumorzellen primär kutaner B-Zell-Lymphome weisen einen dem Keimzentrum ähnlichen Mutationsstatus, nämlich somatische Mutationen und intraklonale Diversifikation, auf (Gellrich S, J Invest Dermatol, 1997; Gellrich S, J Invest Dermatol, 2001). Die Daten sprechen für einen noch aktiven Mutationsmechanismus, sogenannte ongoing mutations (Golembowski S, Immunobiology, 2000). Eine Unterform der kutanen Lymphome stellen die primär kutanen CD30+ T-Zell Lymphome dar. In Untersuchungen mittels Mikromanipulation und Einzelzell-PCR wurden CD30+ Zellen aus primär kutanen CD30+ großzelligen Lymphomen hinsichtlich ihrer T-Zell-Klonalität untersucht. Dabei stellte sich heraus, daß nicht alle atypischen Zellen zur Tumorpopulation gehören. Es wird vermutet, daß ein unbekannter Stimulus zur Ausprägung der Zellmorphe und zur Expression des CD30-Moleküls führt (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2003). Eine weitere Entität, bei welcher CD30+ Zellen eine Rolle spielen, ist die lymphomatoide Papulose. In den hier dargestellten Untersuchungen wurden CD30+ große atypische Zellen einzeln isoliert und anschließend mittels PCR für die Gene des T-Zell-Rezeptor-Gamma und des Immunglobulinrezeptors amplifiziert bei einem Patienten mit lymphomatoider Papulose und assoziierter Morbus Hodgkin-Erkankung. In zwei von drei Fällen waren diese CD30+ Zellen polyklonal. Die aus der Fragmentanalyse bekannte klonale T-Zell-Population konnte dagegen in CD3+CD30- kleinen Zellen gefunden werden. In einem dritten Fall enthielten die CD30+ Zellen klonale B-Zellen, welche die gleichen Immunglobulingene rearrangiert hatten wie Zellen aus einem zuvor bestehenden Hodgkin-Lymphom desselben Patienten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass es für das Aufschießen und die Regredienz der Läsionen der lymphomatoiden Papulose einen Stimulus gibt und die klonalen T- und B-Zellen als Begleitinfiltrat ohne pathologische Bedeutung anzusehen sind. Insgesamt bilden die Daten dieser Arbeit eine Grundlage für eine Fortsetzung der Untersuchung zur Ätiopathogenese von primär kutanen Lymphomen und deren Therapie und bieten die Möglichkeiten vielfältiger wissenschaftlicher Kooperationen. / Primary cutaneous lymphomas present with typical clinical features in dermatology. Although these diseases are rare, they particularly are of scientific and therapeutic interest. The first part of this work deals with the classification and treatment of primary cutaneous lymphomas (PCBCL). The 1997 published EORTC classification will be explained according to the good prognosis of PCBCL. Therapeutic strategies as well as typical procedures (PUVA, excision, irradiation) and gene-technically produced drugs (therapeutic antibodies, vaccination) are illustrated in detail. The second part of this publication focuses on the experimental molecular biological work-out, done in primary cutaneous lymphomas by means of micromanipulation and single cell PCR. For the mycosis fungoides could be shown that in the patch stage only a few malignant T cells can be detected. Increasing infiltrates (plaque-stage) are characterized by epidermotrop or dermally grouped atypical cells. In tumor stage dermal atypical T cells are predominating (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2003). The tumor cells of primary cutaneous B cell lymphomas are comparable with the stage of mutation of follicle centre cells: somatic mutations and intraclonal diversity (Gellrich S, J Invest Dermatol, 1997; Gellrich S, J Invest Dermatol, 2001). The data indicate, that there may be an active mutation mechanism, the so-called ongoing mutations (Golembowski S, Immunobiology, 2000). One subgroup of PCBCL, are presented by the CD30positve entities. By means of micromanipulation and PCR, single cells were investigated due to T cell clonality. Not all atypical cells belong to the malignant population. It is supposed that an unknown stimulus leads to morphological features and CD30 expression (Gellrich S, J Invest Dermatol, 2003). Another CD30positive entity is reflected by the lymphomatoid papulosis. In these experiments large atypical CD30positve cells were isolated and have been investigated via PCR for T cell receptor g or immunoglobuline heavy and light chain gene rearrangement. The majority of the large CD30postive cells (two cases) belong to a polyclonal T cell population. In the opposite, the small CD3positive cells are the cells persisting within the T cell clone. In another case B cells with the same immunoglobulin gene rearrangement like in a preceding Hodgkin disease of the same patient could be detected. The data seem to underline the fact that reactive polyclonal CD30positive cells are triggered by an unkown stimulus with clonal bystander cells without any pathological significance. In summary, this work could be the basis for further investigations about the etiopathogenesis of PCBCL.

Apoptoseresistenzmechanismen spielen bei der Pathogenese maligner Lymphome eine zentrale Rolle. So konnte bei Hodgkin/Reed-Sternbergzellen eine Deregulation des Transkriptionsfaktors NF-_B beobachtet werden, die zu verstärkter Apotoseresistenz führt und so zum malignen Wachstum dieser Zellen wahrscheinlich entscheidend beiträgt. Es konnte gezeigt werden, dass die selektive Blockade von NF-_B sowohl zu erhöhter Apoptosesensitivität als auch zur Inhibition der Zellzyklusprogression in kultivierten Hodgkinzellen führt. Der genaue molekulare Mechanismus der NF-_B-Deregulation in Hodgkinzellen ist jedoch noch unklar. Apoptoseresistenzmechanismen sind nicht nur bei der Pathogenese maligner Lymphome, sondern auch bei der Entstehung von Therapieresistenz von Bedeutung. So konnte gezeigt werden, dass die Überexpression proapoptotischer Gene der bcl-2 Familie in resistenten malignen Zellen sowohl die Empfindlichkeit gegenüber Zytostatika als auch gegenüber Antikörperbehandlung wiederherstellen kann. Neben der bcl-2 Familie spielt wahrscheinlich auch das Apo-I/Fas-System eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Zytostatikaresistenz und immunologischer Resistenz. Somit stellt neben der Überexpression des P-Glykoproteins (MDR1), das als transmembranes "Pumpenprotein" Zytostatika aus der Tumorzelle heraustransportieren kann, die Deregulation Apoptose-steuernder Gene einen weiteren wichtigen Therapie-Resistenzmechanismus dar. Eine Möglichkeit, intrazelluläre Resistenzmechanismen zu umgehen, stellt die indirekte Induktion von Zelltod mit Hilfe bispezifische Antikörper dar. Durch diese Moleküle kann eine T-Zell-vermittelte Zellyse von Lymphomzellen erreicht werden. / Resistance towards apoptosis plays an important role in the pathogenesis of malignant lymphomas. It could be demonstrated that deregulation of the transcription factor NF-kB is a common molecular defect of Hodgkin/Reed-Sternberg cells that leads to enhanced resistance towards apoptosis and therefore probabaly contributes to the malignant growth of these cells. It couldbe shown that blocking of NF-kB leads to increased sensitivity towards apoptosis and decreased cell cycle progression. The precise molecular mechanism that leads deregulation of NF-kB is still unknown. Besides its role in the pathogenesis of malignant lymphoma resistance towards apoptosis plays an important role in the development of drug resistance. It could be shown that overexpression of pro-apoptotic members of the bcl-2 family in resistant tumor cells can restore sensitivity towards both cytotoxic drugs as well as antibody treatment. In addition to the bcl-2 family the Apo-I/Fas system is also involved in the development of drug resistance. Thus, besides overexpression of p-glycoprotein (MDR-1) that might pump cytotoxic drugs out of a malignant cell deregulation of apoptosis regulating genes is another important mechanisms of drug resistance development. One possibility to overcome drug resistance is the induction of cell death via bispecific antibodies. These molecules can induce T cell mediated lysis of lymohoma cells.

Die aberrante Aktivierung des NOTCH Signalweges trägt entscheidend zu verschiedensten malignen Erkrankungen im Menschen bei. Basierend auf der Analyse von hochdimensionalen Microarray-Datensätzen von klassischen Hodgkin Lymphoma Fällen und nicht-Hodgkin Fällen, haben wir eine Hodgkin Lymphoma-spezifische NOTCH Signatur identifiziert. Diese wird von dem essentiellen NOTCH-Koaktivator Mastermindlike 2 (MAML2) signifikant dominiert. Auf der Grundlage dieses Resultates haben wir die Rolle von MAML2 im Kontext des Hodgkin Lymphoma-spezifischen, aberrant regulierten NOTCH Signalweges weiter untersucht. Die signifikante Überexpression von MAML2 im Hodgkin Lymphom konnte in verschiedenen Hodgkin Lymphom Zelllinien und auch durch die immunhistochemische Analyse von primären Hodgkin Lymphom Fällen verifiziert werden. Mit Hilfe des Knockdowns von MAML2 bzw. der Inhibition des NOTCH Signalweges durch die Verwendung einer kompetitiv, dominant-negativ wirkenden, trunkierten Variante von MAML1 konnte daraufhin gezeigt werden, dass die Überexpression von MAML2 der limitierende Faktor für die Hodgkin Lymphomaspezifische, pathologische Deregulation des NOTCH Signalweges ist. Die MAML2- vermittelte Überaktivierung des NOTCH Signalweges ist darüber hinaus essentiell für die Proliferation von Hodgkin Lymphom Zelllinien und die aberrante Expression der NOTCH Zielgene HES7 und HEY1. Das konstitutive Vorhandensein von aktiviertem, intrazellulären NOTCH1 in Hodgkin Lymphom Zelllinien impliziert darüber hinaus,dass der Signalweg im Hodgkin Lymphom zellautonom aktiviert ist. In dieser Arbeit wird damit ein neuer, pathologisch hochwirksamer Mechanismus der NOTCH Signalweg-Deregulation aufgedeckt. / Inappropriate activation of the NOTCH signaling pathway, e.g. by activating mutations, contributes to the pathogenesis of various human malignancies. Using a bottom up approach based on the acquisition of high–dimensional microarray data of classical Hodgkin lymphoma (cHL) and non-Hodgkin B cell lymphomas as control, we identify a cHL specific NOTCH gene-expression signature dominated by the NOTCH co-activator Mastermind-like 2 (MAML2). This set the basis for demonstrating that aberrant expression of the essential NOTCH co-activator MAML2 provides an alternative mechanism to activate NOTCH signaling in human lymphoma cells. Using immunohistochemistry we detected high-level MAML2 expression in several B cell-derived lymphoma types, including cHL cells, whereas in normal B cells no staining for MAML2 was detectable. Inhibition of MAML protein activity by a dominant negative form of MAML or by shRNAs targeting MAML2 in cHL cells resulted in down-regulation of the NOTCH target genes HES7 and HEY1, which we identified as overexpressed in cHL cells, and in reduced proliferation. In order to target the NOTCH transcriptional complex directly we developed short peptide constructs that competitively inhibit NOTCH dependent transcriptional activity as demonstrated by NOTCH reporter assays and EMSA analyses. We conclude that NOTCH signaling is aberrantly activated in a cell autonomous manner in cHL. This is mediated by high-level expression of the essential NOTCH coactivator MAML2, a protein that is only weakly expressed in B cells from healthy donors. Using short peptide constructs we moreover show, that this approach is promising in regard to the development of NOTCH pathway inhibitors that will also work in NOTCH associated malignancies that are resistant to -secretase inhibition.

PCR und Fluoreszenz - DNA - Fragment - Analyse zum Nachweis einer monoklonalen B-Zell-Population zur Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome (CBCL) Der Nachweis einer monoklonalen B-Zell Population mittels PCR hat sich seit ca. zehn Jahren ergänzend zu Klinik und Histopathologie in der Diagnostik der kutanen B-Zell Lymphome etabliert. Zu diesem Zweck wurden Primer für die IgH Framework-Regionen (FR1, 2, 3), die Leader-Sequenz und für die JH-Region sequenziert. Alle Primervarianten führen zur Amplifikation der hochvariablen CDR-3 Region, welche für jede B-Zelle spezifisch ist. Die Kapillarelektrophorese mit fluoreszenzmarkierten PCR-Produkten an automatischen Sequenziergeräten (z. B. Genescan ABI Prism 310) ermöglicht eine exakte Größenbestimmung des jeweiligen Fragmentes und ist daher in diesem Zusammenhang die geeignetste Methode. Zunächst wurden alle relevanten Primer mit der Simulationssoftware Oligo hinsichtlich ihrer Bindungseigenschaften geprüft. Danach wurden ausgewählte Primer-Sets an 58 in Paraffin eingebetteten und an 5 Kryoproben von sicher diagnostizierten CBCL-Patienten getestet. Die fluoreszenzmarkierten Produkte wurden mit dem Sequenziergerät ABI Prism 310 analysiert. Die ungeschachtelte FR3/JH-PCR konnte nur in 30% und zusammen mit der halbgeschachtelten FR3/JH-PCR nur in 37% der Fälle klonale B-Zellen nachweisen. Die Detektionsrate erhöhte sich auf 54% unter Einbeziehung der geschachtelten FR1/JH-PCR und schließlich auf 60% mit einer zusätzlichen geschachtelten FR2/JH-PCR. Das Auftreten von Pseudoklonen (variierende Größe des klonalen Peaks bei Wiederholung der PCR) bei den geschachtelten PCR machte eine Prüfung auf Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unbedingt erforderlich. Die höchste Rate an Pseudoklonen zeigte die FR2/JH-PCR. Aufgrund der schlechten Qualität der IgH Leader-PCR konnten mit in Paraffin-eingebetteten Proben keine Amplifikate erzeugt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, daß gemeinsame Verwendung der in dieser Arbeit entwickelten PCR eine Sensitivitätssteigerung von 30% auf 60% ermöglichen. / Clonality detection in cutaneous B-cell lymphomas (CBCL) using immunoglobulin heavy chain gene PCR assays and fluorescence PCR-fragment analysis on automated DNA sequencer Detection of clonally expanded immunoglobulin heavy chain (Igh) gene rearrangements by PCR and subsequent electrophoresis is increasingly used in the diagnosis of cutaneous B-cell lymphomas (CBCL). To this end, primers for the three Igh framework regions (FR1,2, 3), the leader sequence and the Jh region are applied, all amplifying the highly variable IgH third complementary region (CDR3) Recently, fluorescence PCR-fragment analysis on automated DNA sequencers (GeneScan analysis, GSA), providing an exact sizing has been applied as appropriate seperation technique in this context. We have evaluated all Igh primers hitherto known by a PC primer analysis program. Then, fluorescently labeled products generated from DNAs of 58 paraffin embedded and 5 frozen lesional skin biopsies of confirmed CBCL cases using the primer sets selected, were analysed by GSA on the ABI 310 Prism instrument. Single round or seminested FR3/JH-PCR showed clonal B-cells only in 30 or 37% of cases, respectively. This fraction was increased to 54% including a nested FR1/JH-PCR, and, to 60% applying a supplementary nested FR2/JH-PCR. However false clonal results, indicated by peaks of varying sizes from repeated PCR, have been received by nested PCR, mostly by FR2/JH. Obviously due to their poor quality, the IgH leader-PCR has not yielded amplification products from paraffin-derived DNAs. Our data show that the FR3/JH-PCR only is not sufficient for detecting B-cell clonality in CBCL, but following inclusion of additional IgH-PCR, an increase of detection rate up to 60% is possible. A substantial number of cases still fail to show clonality.

Zusammenfassung Die molekularbiologischen Untersuchungen der variablen Genabschnitte der Immunglobulingene von Lymphomzellen zweier Patienten mit kutanen B-Zell-Lymphomen wurden in der vorliegenden Arbeit mittels Einzel-Zell-PCR-Technik durchgeführt. Die erfolgte Analyse galt bevorzugt dem Aspekt der intraklonalen Diversität. Die Sequenzanalysen der Ig-Gene für die leichte Kette aus den insgesamt 100 untersuchten Tumorzellen des Patienten WS ergaben, daß zwischen den Zellen aus drei voneinander entfernt lokalisierten Gewebeproben intraklonale Diversität vorlag. Aufgrund der Mutationsanalysen und der Zuordnung der Subklone zu den Entnahmeorten ist eine evtl. antigengetriebene Entwicklung des Tumorklons zu vermuten. Bei Patient LB konnte trotz des großen Aufwandes, der Untersuchung von insgesamt 126 Zellen aus acht räumlich getrennten Biopsien, keine intraklonale Diversität für die schwere Kette der Immunglobulingene aufgezeigt werden. Die Sequenzunterschiede der leichten Kette beruhen auf einer einzigen stummen Mutation im Bereich der CDR 1, die keinen funktionellen Einfluß auf die Aminosäuresequenz hat und deshalb geringe prognostische Bedeutung besitzt. In beiden Fällen lagen hypermutierte Immunglobulingene vor. Die Tumorzellen des Patienten WS sind aus molekularbiologischer Sicht Keimzentrumszellen, die des Patienten LB eher Nachkeimzentrumszellen zuzuordnen. Die gewonnenen Erkenntnisse zeigen, daß bei der Untersuchung und Erforschung der Pathogenese von kutanen B-Zell-Lymphomen eine gewonnene Gewebeprobe nicht repräsentativ für den gesamten Tumor sein muß. Veröffentliche Ergebnisse, bei denen Monoklonalität anhand einer Biopsie postuliert wurde, müssen daher initial überdacht werden (74;76;77;84). Es ist folglich in Betracht zu ziehen, daß bei einer exakten molekularbiologischen Zuordnung der Tumorzellen zu ihrem Entwicklungsstadium und ihrer Herkunft räumliche als auch zeitliche Faktoren zu beachten sind. Eine chronologische Untersuchung könnte aufzeigen, ob andauernde Mutationen in den Tumorzellen stattfinden. Die Mikromanipulation und die Einzel-Zell-PCR-Technik sind elegante Methoden, um intraklonale Sequenzunterschiede aufzuzeigen und einen Beitrag für die molekularbiologische Erforschung der Pathogenese von kutanen B-Zell-Lymphomen zu leisten. Eine Kontrolle von malignoproliferativen Krankheiten, ob es unter den heutigen Therapiemöglichkeiten gelingt, den malignen Tumorklon vollständig zu beseitigen oder Aussagen über Progredienz und Prognose zu treffen, wäre ein interessanter Einsatzbereich dieser Methode. / abstract The molecularbiological investigation of the immunoglobulin variable region genes of two patients suffering on primary cutaneous B-cell-lymphoma was carried out using single-cell- PCR technic. The main focus lay on the aspect on the aspect of detecting intraclonal diversity. The sequence nucleotid-analysises of the immunoglubulin light chain genes obtained from a total of 100 investigated tumor B-cells in patient WS revealed intraclonal diversity among cells isolated from three spatially separated tissue samples. Considering the mutational pattern and the subclones in dependence on the tumorcells, taken from different topographical tumorsides, an antigen-driven clonal expansion could be supposed. Despite extensive efforts and the analysis of altogether 126 tumor B-cells out of eight spatially different localised biopsies, no intraclonal diversity could be observed for the immunoglobulin heavy chain rearrangement of second patient LB. Sequence differences of the Ig light chain based on only a single silent mutation within the CDR1 region. This mutation has no functional affect of the amino acid sequence and therefore little prognostical significance. In both cases the immunoglobulin genes were somatically hypermutated in compromise to the germ-line gene. From the molecularbiological point of view, the tumor cells of patient WS descended from germinal center cells, whereas the tumor B-cells of patient LB rather can be characterized as post-germinal center cells. The results clearly demonstrate, that the investigation of a single tissue sample of primary cutaneous B-cell lymphoma using micromanipulation and single cell-PCR technic may not be representative for the whole tumor. Publications concluding monoclonality with no intraclonal diversity from the analysis of a single biopsie therefore have to be interpreted with caution (74;76;77;84). Accordingly, an appropiate molecularbiological characterization of tumor B-cells regarding their developmental stage and origin has to consider spatial and time dependant aspects. Only the investigation of sequential biopsies may reliably detect ongoing mutations in tumor B-cells. The combination of micromanipulation and single cell PCR represents an elegant method to observe intraclonal diversity. The technic will give contribution to molecularbiological investigation of the pathogenesis of primary cutaneous B-cell lymphomas. It could be of interest to apply this method to the evaluation of current therapies with respect to its capability to eradicating the malignant cell clone completely, and to draw conclusions on disease progression and prognosis.