Δύο από τα σημαντικότερα δομικά και λειτουργικά βιομόρια του εξωκυττάριου χώρου είναι το κολλαγόνο και οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs), ανιοντικοί πολυσακχαρίτες που αποτελούν το βασικό δομικό συστατικό των πρωτεογλυκανών. Οι κύριοι τύποι γλυκοζαμινογλυκανών είναι η θειική χονδροϊτίνη, η θειική δερματάνη, η ηπαρίνη, η θειική ηπαράνη, η θειική κερατάνη και το υαλουρονικό οξύ. Το κολλαγόνο τύπου Ι είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη στους ιστούς των θηλαστικών. Το κολλαγόνο τύπου ΙΙ αποτελεί το κύριο συστατικό του εξωκυττάριου χώρου του αρθρικού χόνδρου και άλλων ιστών. Τα παραπάνω μακρομόρια είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση διαφόρων διεργασιών των κυττάρων τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως παθήσεις των αρθρώσεων και νεοπλασματικές ασθένειες.
Αντικείμενο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και των δύο τύπων κολλαγόνου, η οποία θα συνεισφέρει στη βαθύτερη κατανόηση της βιολογικής τους λειτουργίας. Μερικές από τις τεχνικές που έχουν χρησιμοποιηθεί για το συγκεκριμένο σκοπό είναι η χρωματογραφία συγγένειας, η ηλεκτροφόρηση και η φασματοσκοπία φθορισμού. Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), η περίθλαση ακτίνων-Χ και ο κυκλικός διχρωισμός (Circular Dichroism, CD) προσφέρουν δομικές πληροφορίες για τις αλλαγές στη διαμόρφωση και τα σημεία πρόσδεσης μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και πρωτεϊνών. Θερμοδυναμικές πληροφορίες για τις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-γλυκοζαμινογλυκανών αντλούνται από τη θερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης (Isothermal Titration Calorimetry, ITC), ενώ με την τεχνική της διέγερσης επιφανειακών πλασμονίων (Surface Plasmon Resonance, SPR) μελετώνται η σταθερά σύνδεσης και η σταθερά διάστασης της αλληλεπίδρασης σε πραγματικό χρόνο. Το κυριότερο μειονέκτημα των παραπάνω τεχνικών είναι το ότι δεν προσφέρουν πληροφορίες για χημικούς δεσμούς, ενώ ο χρόνος ανάλυσης είναι μεγάλος και απαιτούνται μεγάλες ποσότητες δειγμάτων.
Η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε ήταν εκείνη της φασματοσκοπίας micro-Raman, μια μη καταστρεπτική τεχνική, η οποία προσφέρει πληροφορίες για τη χημική δομή του εξεταζόμενου δείγματος, ενώ παράλληλα είναι γρήγορη και ακριβής. Παρασκευάστηκαν δύο είδη μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών με κολλαγόνο. Στην πρώτη περίπτωση, κολλαγόνο τύπου Ι ή τύπου ΙΙ εμβαπτίστηκε σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης, ηπαρίνης ή μίγμα τους που παρασκευάστηκε με αναλογία όγκων 1:1. Στη δεύτερη περίπτωση, μίγματα των δύο ουσιών προέκυψαν με ανάμιξη ίσων ποσοτήτων των δύο ουσιών. Τα παραπάνω μίγματα μελετήθηκαν με φασματοσκοπία Raman και με την τεχνική της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC) και συγκρίθηκαν με τα φάσματα των προτύπων ουσιών.
Κάθε ουσία έχει ένα χαρακτηριστικό φάσμα Raman, η ερμηνεία του οποίου οδήγησε στην ταυτοποίηση χαρακτηριστικών ομάδων των μορίων, όπως οι δεσμοί C-OH, οι θειικές ομάδες (O-SO3-, N-SO3-), η Ν-ακετυλομάδα, οι δεσμοί C=O και οι δεσμοί C-Ν.
Οι φασματικές περιοχές που παρουσιάζουν τα πιο έντονα χαρακτηριστικά στα φάσματα Raman των μιγμάτων GAG-κολλαγόνου είναι οι εξής: 800-920 cm-1, 900-1000 cm-1 και 980-1170 cm-1. Όσον αφορά στην τελευταία φασματική περιοχή, παρατηρήθηκε σημαντική μετατόπιση της χαρακτηριστικής κορυφής της δόνησης έκτασης των θειομάδων προς χαμηλότερους κυματάριθμους (από τους 1070 cm-1 περίπου στους 1062-1064 cm-1) και η εμφάνιση μιας κορυφής στους 1072 cm-1, σε σχέση με τα αντίστοιχα φάσματα των προτύπων ουσιών, στα φάσματα όλων των μιγμάτων που μελετήθηκαν. Η μετατόπιση της συγκεκριμένης κορυφής αποτελεί ένδειξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο ουσιών και καταδεικνύει το σημαντικό ρόλο των θειομάδων των γλυκοζαμινογλυκανών στις αλληλεπιδράσεις τους με τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη.
Τα αποτελέσματα της φασματοσκοπίας Raman βρίσκονται σε συμφωνία με εκείνα που προκύπτουν από την τεχνική της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSC), καθώς τα θερμογραφήματα DSC των μιγμάτων θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι είναι διαφορετικά από εκείνο του μίγματος που προέκυψε από την ανάμιξη των δύο συστατικών, υποδεικνύοντας την ύπαρξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο ουσιών.
Με την τεχνική της φασματοσκοπίας Raman διαπιστώθηκε ότι το κολλαγόνο τύπου Ι έδειξε μεγαλύτερη «χημική προτίμηση» προς την ηπαρίνη σε σχέση με τη θειική χονδροϊτίνη, ενώ το κολλαγόνο τύπου ΙΙ προτίμησε να αλληλεπιδράσει με τη θειική χονδροϊτίνη. / Collagen and glycosaminoglycans (GAGs) co-exist as major constituents of the extracellular matrix (ECM) in a variety of tissues. Collagen type I is the most abundant protein in the human body, whereas another important type of collagen is type II, which forms the extracellular matrix of cartilage and other tissues. Glycosaminoglycans are negatively charged polysaccharides that occur as a structural component of proteoglycans and can be divided in four major groups: i) chondroitin sulfate and dermatan sulfate, ii) heparin and heparin sulfate, iii) keratan sulfate, and iv) hyaluronic acid. Both GAGs and collagen not only regulate a variety of cellular functions but they also seem to be involved in many pathological conditions, including cancer and joint diseases. Therefore, a more detailed investigation of the interactions between them will result in a deeper understanding of their biological function.
Most common methods for identifying GAG-collagen interactions include affinity chromatography, affinity electrophoresis and fluorescence spectroscopy. Nuclear Magnetic Resonance (NMR), X-ray diffraction and Circular Dichroism (CD) provide structural data characterizing conformational changes and contact points between the interacting species. Using Isothermal Titration Calorimetry (ITC), information on the thermodynamics of glycosaminoglycan-protein interactions can be obtained. Surface Plasmon Resonance (SPR) allows the measurement of association and dissociation constants of glycosaminoglycan-protein interactions in real time. The major disadvantage of the techniques described above is the inability to identify specific chemical bonds. Other disadvantages are the long analysis time and that large amounts of the interacting substances are required.
In the present work, Raman spectroscopy, a non-destructive, vibrational technique which yields information on the chemical composition of the specimen, was employed for the exploration of the interactions between collagen type I and type II and two glycosaminoglycans, chondroitin sulfate and heparin. Two sets of mixtures composed of glycosaminoglycans and each type of collagen were prepared: i) collagen type I or type II was immersed in aqueous solutions of chondroitin sulfate, heparin and a 1:1 mixture of both GAGs, and ii) GAG-collagen mixtures were obtained by blending suitable amounts of the two substances. Differential Scanning Calorimetry (DSC) was also applied on the latter mixtures.
From the Raman spectra identification of vibrational frequencies of the functional groups of the above molecules, such as C-OH linkages, sulfate groups (O-SO3-, N-SO3-), N-acetyl group, carboxyl group and C-Ν linkages is possible.
The prominent features arising from the Raman spectra of GAG-collagen interactions are found in the regions 800-920 cm-1, 900-1000 cm-1 and 980-1170 cm-1. Processing of the spectra of all GAG-collagen mixtures has revealed that a shift of the most characteristic vibration of chondroitin sulfate’s and heparin’s spectrum from 1070 cm-1 to 1062-1064 cm-1, while a vibration at approximately 1072 cm-1 emerges. The sulfate band shift is indicative of an interaction between collagen and glycosaminoglycans and depicts the important role of the sulfate group of glycosaminoglycans in the interactions with the protein. This observation was in accordance with the results from Differential Scanning Calorimetry (DSC), which demonstrated an interaction between collagen and chondroitin sulfate.
A stronger preference of collagen type I to interact with heparin rather than chondroitin sulfate and of collagen type II to interact with chondroitin sulfate was also observed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/7649 |
| Date | 27 May 2014 |
| Creators | Καμηλάρη, Ελένη |
| Contributors | Κοντογιάννης, Χρίστος, Kamilari, Eleni, Κοντογιάννης, Χρίστος, Όρκουλα, Μαλβίνα, Λάμαρη, Φωτεινή |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0029 seconds