Η χρονική και χωρική ρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής του DNA
συντονίζεται από τη διαδικασία της «αδειοδότησης της αντιγραφής», η οποία
εξασφαλίζει ότι η αντιγραφή θα λάβει χώρα μόνο μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο. Η
αδειοδότηση της αντιγραφής περιλαμβάνει την κατά βήμα συγκρότηση ενός
συμπλόκου πρωτεϊνών, του προαντιγραφικού συμπλόκου, στις περιοχές έναρξης της
αντιγραφής. Μείζον συστατικό του συμπλόκου αυτού είναι η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία
επίσης αποτελεί πρωτεολυτικό στόχο των σημείων ελέγχου κυττάρων που φέρουν
βλάβες στο DNA. Στα μετάζωα, υπάρχει μια μικρή πρωτεΐνη καλούμενη Geminin, η
οποία προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1, αναστέλλοντας την αδειοδότηση της
αντιγραφής. Η πρωτεΐνη Geminin αλληλεπιδρά με ομοιοτικούς μεταγραφικούς
παράγοντες και πρωτεΐνες που αναδιαμορφώνουν τη χρωματίνη και πιστεύεται ότι
αποτελεί πιθανό κρίκο που συνδέει τις διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της
διαφοροποίησης.
Στην παρούσα μελέτη δείξαμε πως η πρωτεΐνη Geminin κατατμείται σε
πρωτογενή κύτταρα και καρκινικές κυτταρικές σειρές που οδηγούνται προς
απόπτωση. Η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin διαμεσολαβείται από την κασπάση-
3 τόσο in vivo όσο και in vitro. Δύο περιοχές στο καρβοξυτελικό τμήμα της Geminin
(Κ1 και Κ2), στοχεύονται κατά την απόπτωση προκαλώντας τη δημιουργία
θρυσμάτων της πρωτεΐνης Geminin. Δείξαμε ότι η κατάτμηση της πρωτεΐνης
Geminin στη θέση Κ1 προάγει τον αποπτωτικό φαινότυπο και ρυθμίζεται μέσω
φωσφορυλίωσης από την κινάση Casein Kinase II. Αντίθετα, μετά από κατάτμηση
στη θέση Κ2, η πρωτεΐνη Geminin χάνει την ικανότητα αλληλεπίδρασης με την
πρωτεΐνη Brm, καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου αναδιαμόρφωσης της
χρωματίνης SWI/SNF, ενώ διατηρεί την ικανότητα να προσδένεται στην πρωτεΐνη
Cdt1, υποδεικνύοντας πως η στόχευση της πρωτεΐνης Geminin κατά την απόπτωση,
επηρεάζει διαφορικά τη λειτουργία του μορίου.
Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διερευνήσαμε τη ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1
στο χώρο και στο χρόνο σε κύτταρα με βλάβες στο DNA. Για το σκοπό αυτό,
χαρακτηρίσαμε μια μέθοδο που προκαλεί εντοπισμένες βλάβες στο DNA των
κυττάρων, βασιζόμενη στη χρήση ενός παλμικού UVA laser. Με τη χρήση της
μεθόδου αυτής, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης
τόσο σε καρκινικά όσο και πρωτογενή κύτταρα, παράλληλα με πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική απόκριση στη βλάβη (γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70,
pATM κ.ά.). Η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 λαμβάνει χώρα ταχύτατα και
προηγείται της αποικοδόμησής της. Με τη δημιουργία μεταλλαγμένων μορφών της
πρωτεΐνης Cdt1 και την καταστολή της έκφρασης πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με
την πρωτεΐνη Cdt1 με τη χρήση siRNA, δείξαμε πως η στρατολόγηση της πρωτεΐνης
Cdt1 στην περιοχή της βλάβης απαιτεί αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη PCNA.
Βρέθηκε πως η πρωτεΐνη Cdt2, που αποτελεί μέλος του συμπλόκου της λιγάσης της
ουβικουϊτίνης Cul4-DDB1Cdt2 επίσης στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης.
Ποσοτικοποίηση της κινητικής συσσώρευσης πρωτεϊνών στην περιοχή της βλάβης
έδειξε ότι η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 υφίσταται κορεσμό νωρίτερα από τις
πρωτεΐνες PCNA και Cdt2, ενώ αποσιώπηση της πρωτεΐνης Cdt1 δεν επηρεάζει τη
στρατολόγηση των πρωτεϊνών PCNA και Cdt2. Πειράματα προσδιορισμού κινητικών
αλληλεπιδράσεων με τη μέθοδο FRAP, έδειξαν ότι η πρωτεΐνη PCNA παραμένει
σταθερά προσδεδεμένη στην περιοχή της βλάβης, ενώ η πρωτεΐνη Cdt1 εμφανίζει
ιδιαίτερα γρήγορη κινητική. Οι μελέτες αυτές οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η
πρόκληση εντοπισμένης βλάβης στο DNA οδηγεί σε εντοπισμένη κυτταρική
απόκριση και στη στρατολόγηση της πρωτεΐνης PCNA στην περιοχή της βλάβης η
οποία δρά ως ικρίωμα για τη δυναμική αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Cdt1.
Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της διδακτορική διατριβής περιγράφεται για
πρώτη φορά ότι η πρωτεϊνη Geminin στοχεύεται για κατάτμηση κατά την απόπτωση,
διαλευκάνονται τα μοριακά μονοπάτια που ρυθμίζουν το φαινόμενο αυτό και
διερευνάται η φυσιολογική του σημασία. Προτείνεται ότι η στόχευση της Geminin
από την κασπάση 3 επηρεάζει τη φυσιολογική ισορροπία μεταξύ κυτταρικού
πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης. Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής
διατριβής δείχνεται ότι η πρωτεϊνη Cdt1 στρατολογείται σε περιοχές της χρωματίνης
που φέρους βλάβες στο DNA. Η στρατολόγηση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της
βλάβης, παράλληλα με πρωτεϊνες απόκρισης στη βλάβη όπως οι BRCA1, pATM και
Ku70, οδηγεί σε μία νέα υπόθεση για πιθανή εμπλοκή της πρωτεϊνης Cdt1 στην
κυτταρική απόκριση σε βλάβες στο DNA. / The timely initiation of DNA replication is achieved through a process called
licensing, which ensures that only after passage through mitosis the chromatin
becomes competent for a new round of DNA replication. Licensing involves the
stepwise formation of a multiprotein complex at the origins of replication, called prereplicative
complex. A major component of this complex is Cdt1, which is also a
critical and evolutionarily conserved proteolytic target of the DNA damage
checkpoint. In metazoans, a small protein called Geminin binds to Cdt1, inhibiting
replication licensing. Geminin has been proposed to coordinate cell cycle and
differentiation events through balanced interactions with the cell cycle regulator Cdt1
and with homeobox transcription factors and chromatin remodeling activities
implicated in cell fate decisions.
Here we show that Geminin is cleaved in primary cells and cancer cell lines
induced to undergo apoptosis by a variety of stimuli. Geminin targeting is mediated
by caspase-3 both in vivo and in vitro. Two sites at the carboxyl terminus of Geminin
are cleaved by the caspase (termed K1 and K2), producing truncated forms of
Geminin. We provide evidence that Geminin cleavage is regulated by phosphorylation
by Casein kinase II. Geminin cleaved at site K1 has a proapoptotic effect. Geminin
cleaved at the site K2 has lost the ability to interact with Brahma (Brm), a catalytic
subunit of the SWI/SNF chromatin remodeling complex, while binding efficiently to
Cdt1, indicating that targeting of Geminin during apoptosis differentially affects
interactions with its binding partners.
In the second part of this thesis, we investigated the spatiotemporal regulation of
Cdt1 in DNA-damaged cells. We introduced and characterized a method of inducing
localized DNA damage, based on a UVA-pulsed laser. Using this method, we show
that Cdt1 is recruited at the site of damage in parallel to the recruitment of known
response factors, such as γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70 etc. Cdt1 recruitment at the
site of damage precedes its degradation in both cancer cell lines and primary cells.
Mutated forms of Cdt1 and siRNA for Cdt1-interacting proteins show that Cdt1
accumulation at the site of damage requires interactions with the protein PCNA. In
addition, we found that Cdt2, a member of the Cul4-DDB1Cdt2 complex that
ubiquitinates Cdt1 after DNA damage, is recruited at the site of damage. Experiments
of knocking down the protein expression using siRNA and quantification of the recruitment kinetics address the molecular interplay of these proteins for the
recruitment at the site of damage, while FRAP experiments revealed their dynamics.
Taken together our results suggest that following DNA damage, PCNA is recruited to
the site of damage, and acts as a scaffold for the dynamic interaction of Cdt1 with the
damaged sites. The accumulation of Cdt1 at the site of damage suggest a possible
involvement this cell cycle regulator in the DNA damage response.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/4455 |
| Date | 08 July 2011 |
| Creators | Ρούκος, Βασίλειος |
| Contributors | Λυγερού, Ζωή, Roukos, Vassilios, Λυγερού, Ζωή, Τσαμπάος, Διονύσιος, Γεωργάτος, Σπυρίδων, Ζούμπος, Νικόλαος, Μοσχονάς, Νικόλαος, Καλόφωνος, Χαράλαμπος, Βαράκης, Ιωάννης |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 12 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.002 seconds