A lesão pulmonar aguda (LPA) é caracterizada por inflamação pulmonar de início súbito com recrutamento de polimorfonucleares e liberação de mediadores próinflamatórios. É uma condição grave que evolui com óbito em aproximadamente 40% dos casos. Diversos estudos que elucidaram a fisiopatologia da LPA, o tratamento ainda é insatisfatório. O sistema colinérgico anti-inflamatório foi descrito no pulmão e está relacionado a um reflexo via nervo vago que inibe a liberação de citocinas inflamatórias por efeitos relacionados a ação da acetilcolina em receptores nicotínicos. Nossa hipótese é de que a redução de VAChT, que está relacionada ao déficit na liberação de ACh, module a resposta inflamatória pulmonar em modelo de LPS. Objetivo: 1. Avaliar se a deficiência de VAChT modula a resposta pulmonar em animais geneticamente modificados; 2. Avaliar se a deficiência colinérgica induzida por redução de VAChT está envolvida na resposta pulmonar ao LPS e elucidar alguns mecanismos envolvidos; 3. Avaliar o potencial terapêutico do PNU, um agonista de alfa7nAChR nas alterações funcionais e histopatológicas em modelo de LPA em animais C57Bl6. Metodologia: Foram utilizados camundongos machos geneticamente modificados mutante (VAChT KDHOM) ou selvagem (WT) e C57BL/6. Inicialmente avaliamos a função pulmonar e a histopatologia pulmonar em animais VAChT KDHOM. Após, animais WT e VAChT KDHOM receberam instilação intranasal de LPS ou salina e a resposta inflamatória foi avaliada de 1,5h até 72 horas após. Ainda, foi avaliado a resposta pulmonar em VAChT KDHOM e WT após a instilação de LPS intraperitoneal. Por fim, animais C57BL/6 instilados com LPS intranasal, receberam tratamento prévio ou após com PNU, agonista do receptor nicotínico alfa7. Resultados: Animais mutante apresentaram maior quantidade de células recuperadas no lavado bronco alveolar (LBA) e aumento de citocinas próinflamatórias, aumento de edema peribrônquico e piora da função pulmonar. Ainda, observamos aumento da expressão de NF-kB e redução de JAK2. A deficiência de VAChT induziu aumento de células inflamatórias em animais que receberam LPS somente em 1.5h após a indução, sendo os valores iguais ao dos animais WT em 24 e 72 horas. Nos animais WT, o estimulo do receptor nicotínico melhora a inflamação, enquanto o estímulo de receptores muscarínicos parece contribuir com a piora da resposta da inflamação pulmonar. Os efeitos do PNU parecem que dependem da via colinérgica intacta, uma vez que esta droga não teve o mesmo efeito em animais mutante. Entretanto, o tratamento com PNU em animais C57BL/6 reduziu a inflamação, a produção de citocinas, a deposição de colágeno no tecido pulmonar e os níveis de MMP-2, MMP-9 e TIMP-1, melhorando a função pulmonar. Estes efeitos parecem estar associados a redução de macrófagos perfil M1, e a inibição de NF-kB. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o sistema colinérgico anti-inflamatório está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar, seja na manutenção da homeostasia ou ainda nas fases iniciais do desenvolvimento da LPA. Ainda, está claro que o estímulo de receptores nicotínicos tem grande potencial como alvo terapêutico a ser explorado na SDRA / Acute lung injury (ALI) is characterized by acute lung inflammation with recruitment of polymorphonuclear and release of proinflammatory mediators. It is a severe condition since leads to death 40% of the cases. Several studies have elucidated the pathophysiology of ALI, however the treatment is still unsatisfactory. The anti-inflammatory cholinergic system was described in the lung and is related to a vagal nerve reflex that inhibits the release of inflammatory cytokines by the action o ACh on nicotinic receptors. Our hypothesis is that the VAChT reduction, which is related to the deficit in the release of ACh, modulates the pulmonary inflammatory response in a model of LPS. Aim: 1. To assess whether VAChT deficiency modulates the pulmonary response in genetically modified animals; 2. Assess whether cholinergic deficiency induced reduction VAChT is involved in pulmonary response to LPS and elucidate some mechanisms involved; 3. To evaluate the therapeutic potential of PNU, an agonist alfa7nAChR, in functional and histological changes in C57BL6 mice with LPA. Methods: Mutant genetically modified male mice (VAChT KDHOM) or wild (WT) and C57BL/6 were used. First, we evaluated lung function and lung histopathology in VAChT KDHOM animals. After, WT animals and VAChT KDHOM received intranasal instillation of LPS or saline and the inflammatory response was assessed 1.5 hours to 72 hours. Moreover, the pulmonary response was evaluated in WT and VAChT KDHOM after instillation of LPS intraperitoneally. Finally, C57BL6 instilled with intranasal LPS received prior or post-treatment with PNU, an alfa7 nicotinic receptor agonist. Results: Mutant animals had higher number of cells recovered in brochoalveolar lavage (BAL) and increased pro-inflammatory cytokines, peribronchial edema and worsening of lung function. Still, there was an increase of NF_kB expression and reduction of JAK2. The VAChT deficiency induced increase in inflammatory cells in animals receiving LPS only 1.5h after the LPS instilation, and the values were similar to WT in 24 and 72 hours. In WT mice, the stimulation of the nicotinic receptor improves inflammation, while the stimulation of muscarinic receptors appears to contribute to the worsening of the pulmonary inflammatory response. The effects of PNU seem to depend on the intact cholinergic pathway, since this drug had no effects on mutant animals. However, treatment with PNU in C57BL6 reduced pulmonar inflammation, cytokine production, collagen deposition in lung tissue and the levels of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1, improving pulmonary function. These effects appear to be associated with reduced profile M1 macrophages and the inhibition of NF-kB. Conclusion: These data clearly demonstrate that the anti-inflammatory cholinergic system is involved in the control of lung inflammatory response, both to maintain the lung homeostasis or in the early stages of the development of ALI. Finally, it is clear that the stimulation of nicotinic receptors has great potential as a therapeutic target to be explored in ARDS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04082016-152420 |
| Date | 05 May 2016 |
| Creators | Pinheiro, Nathalia Montouro |
| Contributors | Prado, Carla Máximo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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