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Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O diagnóstico da doença de Chagas crônica (DCC) baseia-se em metodologias que usam em
sua fase sólida antígenos brutos, semipurificados ou recombinantes, podendo resultar em
baixa sensibilidade ou reação cruzada. Uma forma para resolver este problema é o uso de
quimeras formadas por epítopos conservados e repetitivos de diferentes estruturas parasitárias
em uma única molécula. O nosso objetivo foi caracterizar e avaliar o uso de quimeras em
imunoensaios para o diagnóstico da DCC. As quimeras, IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e
IBMP-8.4 foram purificadas por meio de cromatografia e sua pureza avaliada por SDSPAGE.
Ensaios de dicroísmo circular (DC) e espalhamento dinâmico da luz (EDL) foram
usados para avaliação do raio hidrodinâmico das quimeras, avaliação de sua estabilidade e
escolha do sistema tampão que oferecesse o menor estado de agregação molecular. Ensaios
sorológicos para detecção de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi através de ELISA foram
realizados utilizando um painel de 857 amostras positivas para a DCC e 689 negativas. Para
avaliação de reação cruzada foram usadas 1079 amostras de diversas doenças endêmicas no
país. A purificação foi eficiente uma vez que o SDS-PAGE indicou ausência de degradação
das quimeras. As análises de DC e EDL mostraram que as quatro quimeras apresentaram
menor tendência de agregação em tampão carbonato pH 9,6, sendo, assim, este o sistema para
a sensibilização das placas. Os ensaios sorológicos revelaram valores elevados de
sensibilidade (Sen) e especificidade (Esp) para a molécula IBMP-8.4 (Sen-99,3%; Esp-
100%). O desempenho para as demais moléculas foi satisfatório, ficando os valores de Sen e
Esp acima de 94%. As moléculas IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4 apresentaram
respectivamente 0,46%, 0,85%, 0,46% e 0,37% de reação cruzada. Os resultados apontam que
as quimeras atingiram os critérios de proficiência do Ministério da Saúde podendo, dessa forma, ser utilizados em ensaios diagnósticos para a DCC. Chronic Chagas disease (CCD) diagnosis is based on serological methods employing crude,
semipurified or recombinant antigens, which eventually may result in low sensitivity or crossreactivity.
An alternative method for solving this problem is the use of chimeric molecules
composed by conserved and repetitive epitopes of distinct parasite structures. Our objective
was to evaluate the use of chimeras in immunoassays for the diagnosis of CCD. The chimeras
IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP-8.4 were purified by chromatography and their
purity assessed by SDS-PAGE. Circular dichroism (CD) and dynamic light scattering (DLS)
were used to assess the hydrodynamic radius of the chimeras, to evaluate their stability and to
select the buffering system that offers the lowest state of molecular aggregation. Serological
tests for detection of anti-Trypanosoma cruzi were performed by ELISA using a panel of 857
positive and 689 negative serum samples for CCD. Cross-reactivity was assessed by using
1079 serum samples from patients with unrelated diseases. The purification was efficient
since SDS-PAGE indicated the absence of degradation of chimeric proteins. Analyses of CD
and DLS showed that the four chimeras had low aggregation tendency in carbonate buffer, pH
9.6. Serological testing showed high values of sensitivity (Sen) and specificity (Spe) for
IBMP-8.4 (Sen-99.3%; Spe-100%). The performance of other molecules was satisfactory,
being the Sen and Spe values above 94%. Cross-reaction was observed in 0.46%, 0.85%,
0.46% and 0.37% of the samples tested against IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP- 8.4, respectively. The results indicate that the chimeras reached the Brazilian Ministry of Health proficiency criteria and may thus be used in diagnostic assays for CCD.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/14500 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Santos, Fred Luciano Neves |
| Contributors | Krieger, Marco Aurélio, Gomes, Yara de Miranda, Dhália, Rafael, Schindler, Haiana Charifker, Almeida, Alzira Maria Paiva de, Rocha, Abraham Cézar de Brito, Gomes, Yara de Miranda |
| Publisher | Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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