Os neutrófilos são os leucócitos circulantes mais abundantes. Apesar de serem importantes no combate às infecções, o intenso recrutamento e a consequente ativação dessas células levam à liberação de mediadores inflamatórios que estão relacionados com o agravamento do quadro clínico de inúmeras doenças. Dessa forma, nos últimos anos tem-se intensificado a procura por substâncias terapêuticas que minimizem os danos teciduais ocasionados pela infiltração neutrofílica. Estudos prévios do grupo de pesquisa mostraram que as 3-fenilcumarinas, que constituem uma classe de produtos naturais de origem vegetal, são substâncias promissoras como moduladores do metabolismo oxidativo de neutrófilos. Em continuidade a essas investigações, o derivado sintético 3-fenilcumarínico 6,7-diidroxi-3-[3\',4\'- metilenodioxifenil]-cumarina (C13) foi selecionado, por apresentar o grupo substituinte ortodiidroxi nas posições C-6 e C-7 do esqueleto cumarínico e a metilenodioxila ligada ao anel fenílico, no intuito de avaliar o seu efeito nas demais funções efetoras dos neutrófilos, como também em um modelo animal de inflamação articular. Foi avaliado o efeito modulatório in vitro da C13 sobre a quimiotaxia, a produção de ERO e interação com o sítio ativo da mieloperoxidase (MPO), a fagocitose de imunocomplexos (IC), a desgranulação da enzima elastase, a atividade microbicida sobre Candida albicans, a mobilização e o influxo de cálcio, a polimerização do citoesqueleto, e a formação e liberação das NETs em neutrófilos humanos. A C13 inibiu, de forma dependente da concentração, o metabolismo oxidativo de neutrófilos estimulados via receptores de IgG (Fc?R) e/ou de complemento (CR), utilizando-se diferentes tipos de IC e foi capaz de interagir com o sítio ativo da MPO. Nas concentrações próximas da necessária para inibir 50% do metabolismo oxidativo (~ 2µmol/L), a C13 não interferiu nas demais funções efetoras dos neutrófilos avaliadas. No entanto, na maior concentração avaliada (20 µmol/L), a C13 inibiu cerca de: 30% da capacidade das células de migrar a favor dos agentes quimiotáticos n-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) e leucotrieno B4; 70% da fagocitose de IC mediada por CR; 40% e 80% da desgranulação estimulada por fMLP e IC imobilizados, respectivamente; 50% do processo de formação e liberação das NETs. Esta concentração de C13 também interferiu na polimerização do citoesqueleto de actina, mas não inibiu: a quimiotaxia de neutrófilos frente à interleucina (IL) 8; a capacidade fagocítica de IC estimulada via Fc?R e Fc?R+CR; e a atividade microbicida sobre C. albicans. Na segunda parte deste trabalho, foi avaliada a toxicidade da C13 sobre neutrófilos mantidos em condições de cultura celular por 6 e 12 h. Nos períodos avaliados, essa substância não alterou a viabilidade dos neutrófilos. Por último, a C13 foi incorporada em vesículas lipossomais e sua atividade biológica foi avaliada em ratos Wistar com inflamação articular induzida por zimosan. O tratamento dos animais com a C13 lipossomal (1mg/Kg) reduziu a formação do edema e a infiltração de leucócitos e neutrófilos na sinóvia inflamada, mas não alterou a concentração sinovial das citocinas inflamatórias fator de necrose tumoral ?, IL-1? e IL-6. Portanto, o derivado 3-fenilcumarínico C13 pode servir de protótipo para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos com aplicação no tratamento de doenças onde há intensa participação dos neutrófilos. / Neutrophils are the most abundant circulating leukocytes. Although neutrophils are important to fight against infections, the massive recruitment and consequent activation of these cells result in the release of inflammatory mediators that are associated with worsening of the clinical condition in many diseases. In this sense, the search for new therapeutic compounds that minimize tissue damage caused by neutrophil infiltration has been intensified in the past few years. Previous studies have demonstrated that 3-phenylcoumarins, a class of plantderived natural compounds, are promising modulators of neutrophil oxidative metabolism. To continue these investigations, we selected the 3-phenylcoumarin derivative 6,7-dihydroxy-3- [3?,4?-methylenedioxyphenyl]-coumarin (C13), bearing the 6,7-dihydroxyl and the 3?,4?- methylenedioxyl groups, to further assess its effects on the other effector functions of neutrophils, as well as on in an animal model of articular inflammation. We examined the in vitro modulator effect of C13 on the human neutrophil chemotaxis, production of ROS and interaction with active site of myeloperoxidase (MPO), phagocytosis of immune complexes (IC), degranulation, killing of Candida albicans, calcium mobilization and influx, cytoskeleton polymerization, and the formation and release of NETs. C13 inhibited, in a concentration-dependent manner, the neutrophil ROS generation elicited via IgG (Fc?R) and/ or complement (CR) receptors using different types of IC and it interacted with active site of MPO. At concentrations near to that required to suppress the ROS production by 50% (~ 2µmol/L), C13 did not modulate the other neutrophil effector functions assessed. However, at the highest concentration tested (20 µmol/L), C13 inhibited nearly: 30% of the cell ability to migrate towards n-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) and leukotriene B4; 70% of CR-mediated phagocytosis of IC; 40% and 80% of cell degranulation triggered by fMLP and immobilized IC, respectively; and 50% of the NETs formation and release process. Such C13 concentration also interfered in the actin cytoskeleton polymerization, but it did not suppress the neutrophil: chemotaxis towards interleukin (IL) 8; capacity to phagocytose IC elicited via Fc?R and Fc?R+CR; and killing of C. albicans. In the second part of this study, we examined whether C13 was toxic towards neutrophils maintained in culture for 6 and 12 h. At the time points assessed, this compound did not change the viability of neutrophils. Finally, we incorporated C13 into liposomes and examined its biological activity in Wistar rats of zymosan-induced articular inflammation. Treatment of animals with liposomal C13 reduced edema formation, and leukocyte and neutrophil infiltration in the inflamed synovia, but it did not change the synovial concentration of the inflammatory cytokines tumor necrosis factor ?, IL-1?, and IL-6. Therefore, the 3-phenylcoumarin derivative C13 can be a prototype for the development of novel therapeutic agents to be used in the treatment of diseases where neutrophils have intense participation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06012017-145630 |
| Date | 29 September 2016 |
| Creators | Andrade, Micássio Fernandes de |
| Contributors | Valim, Yara Maria Lucisano |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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