A rejeição ao aloenxerto mediada por mecanismos celulares ou humorais representa uma importante complicação no pós-transplante renal. Estudos anteriores demonstraram que o depósito de C4d peritubular é um marcador de rejeição mediada por anticorpos. A técnica padrão ouro para a pesquisa de C4d é a imunofluorescência em criostato. No entanto, o manuseio do material congelado implica em algumas limitações custo-operacionais, particularmente em nosso meio. Nos casos de rejeição mediada por anticorpos é de relevância patogenética a análise da participação de linfócitos B e plasmócitos, pois são as células responsáveis pela produção de anticorpos. Considerando que até o momento o envolvimento de linfócitos B e plasmócitos no processo de rejeição foi pouco investigado, no presente estudo também será analisada a expressão de CD20 e CD138 em biópsias renais, para caracterização destes componentes celulares. Portanto, o objetivo do presente estudo foi analisar a detecção do fragmento C4d por meio de 4 diferentes técnicas, além de analisar o infiltrado de linfócitos B e plasmócitos em biópsias de enxerto renal, correlacionando estes achados com o C4d peritubular. Foram analisadas 107 biópsias de 82 pacientes submetidos a transplante renal. A pesquisa do C4d foi realizada utilizando-se as técnicas de imunofluorescência [IF] (em cortes de criostato e de parafina) e imuno-histoquímica [IH] (em cortes de criostato e de parafina), enquanto que as pesquisas dos linfócitos B e plasmócitos foram realizadas pela técnica de IH em cortes de parafina utilizando-se os anticorpos anti-CD20 e anti-CD138, específicos para linfócitos B e plasmócitos, respectivamente. Com relação à detecção de C4d, as técnicas com maior índice de concordância com a IF-criostato, considerada padrão-ouro, foram IH-criostato (75,6% dos casos apresentaram resultados coincidentes, r=0,72; p<0,0001) e IF-parafina (73%, r=0,59; p=0,0001), enquanto a taxa de concordância na técnica de IH-parafina foi de apenas 51,4% (r=0,35; p=0,03). Analisando a evolução clínica, a sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia foi menor no grupo C4d positivo comparado ao grupo C4d negativo (67% vs 96%, respectivamente, p=0,01). A prevalência de linfócitos B (CD20+) foi de 54% das biópsias de enxerto renal. A análise histológica do infiltrado de linfócitos B revelou 2 padrões distintos de infiltrado: padrão de células isoladas (74%) e padrão nodular (26%). O padrão nodular esteve associado a uma menor sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia (61% vs 89% no grupo CD20 negativo; p=0,03; e 61% vs 87% no grupo padrão de células isoladas; p=0,03). A prevalência de plasmócitos (CD138+) em biópsias de enxerto renal foi de 59%. O infiltrado plasmocitário não esteve associado a uma pior evolução clínica do transplante. A análise da correlação entre C4d peritubular, linfócitos B e plasmócitos demonstrou que o número de células CD20+ e CD138+ foi significativamente maior nos casos C4d positivos comparados aos casos C4d negativos (CD20+: 155±53 vs 26±7 cels/mm2, respectivamente; p=0,001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cels/mm2, respectivamente; p=0,002). O presente estudo concluiu que o depósito peritubular de C4d e o infiltrado de linfócitos B, em especial o padrão nodular, estão associados a uma evolução clínica desfavorável do transplante renal. Outra conclusão importante é que há uma associação positiva entre os infiltrados de linfócitos B e de plasmócitos com o C4d peritubular, sugerindo um possível papel destas células responsáveis pela produção de anticorpos na ativação do sistema complemento in situ. Finalmente, as técnicas de IH-criostato e IF-parafina podem ser consideradas técnicas alternativas à técnica de IF-criostato para a detecção do C4d / Allograft rejection mediated by cellular or humoral mechanisms represents an important complication after kidney transplantation. Capillary C4d deposition was recognized as a specific and independent prognostic marker of antibody mediated rejection. The gold standard technique for C4d detection is the immunofluorescence in cryostat sections. However, this technique involves some operating and costs limitations, particularly in Brazil. In antibody mediated rejection, the analysis of B lymphocytes and plasma cells is of pathogenetic relevance since these cells are responsible for antibody production. Considering that the involvement of B lymphocytes and plasma cells in the rejection process is not clear, in this study the CD20 and CD138 expression in kidney biopsies will be also analyzed. Therefore, the aim of the present study was to analyze the C4d detection by 4 different techniques and the infiltration of B lymphocytes and plasma cells in renal allograft biopsies, correlating these findings with the capillary C4d deposition. One hundred and seven biopsies of 82 renal transplant patients were analyzed. C4d was evaluated by immunofluorescence (IF) and immunohistochemistry (IHC) techniques in frozen and paraffin sections (obtained from the same patients), whereas B-lymphocytes and plasma cells were evaluated by immunohistochemistry in paraffin sections using specific antibodies anti-B Lymphocytes (CD20) and anti-plasma cells (CD138). Regarding the C4d detection, the techniques with higher concordance rate with frozen-IF, considered the gold standard, were the frozen-IHC technique (85.4% of cases showed coincident results, r=0.72; p<0.0001) and the paraffin-IF technique (73%, r=0.59; p=0.0001), whereas the concordance rate in the paraffin-IHC technique was only 51.4% (r=0.35; p=0.03). The clinical follow up analysis demonstrate that C4d positive group was associated with a poor graft survival at 3 years post-diagnosis (67% vs 96% in C4d negative group; p=0.01). The histological analysis of mature B cells (CD20+) infiltrate showed 2 distinct patterns: scattered cells and clusters. The cluster pattern was associated with poor graft survival at 3 years (61% vs 89% in the CD20 negative group; p=0.03; and 61% vs 87% in the CD20+ scattered pattern group; p=0.03). The plasma cells infiltrate was not associated with a worse clinical transplant outcome. The analysis of the capillary C4d and B lymphocytes correlation demonstrate that the number of CD20+ and CD138+ cells was significantly higher in C4d positive cases (CD20+: 155±53 vs 26±7 cells/mm2, respectively; p=0.001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cells/mm2, respectively; p=0.002). This study concluded that C4d capillary and mature B cells (clusters pattern) are associated with worse graft survival. Another important conclusion is a positive association between B lymphocytes (mature B cells and plasma cells) and capillary C4d, suggesting a possible role of these cells, responsible for antibodies production, in the in situ complement system activation. Finally, the frozen-IHC and paraffin-IF techniques may be considered alternative to frozen-IF technique for C4d detection
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-07052010-145241 |
| Date | 07 April 2010 |
| Creators | Hugo Ludovico Martins |
| Contributors | Irene de Lourdes Noronha, Luiz Estevam Ianhez, Roberto Ceratti Manfro, Dino Martini Filho, Álvaro Pacheco e Silva Filho |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Nefrologia, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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