Fluorescerande protein kan användas som reportrar i genetiska kretsar för att identifiera framgångsrikt modifierade celler. Med hjälp av syntetisk biologi kan genetiska kretsar, som är en sammansättning gener som kodar för protein, skapas. Genetiska kretsar möjliggör modifiering av celler och har haft stor framgång, vid immunterapi av cancer. Chimeric antigen receptor (CAR) T-celler är en genetisk krets där T-celler modifieras till att eliminera tumörceller baserat på en utvald ytmarkör. Med hjälp av fluorescerande proteiner kan olika komponenter i genetiska kretsar märkas in och därmed tydligt följas vid modifieringen av celler, ofta används Blue fluorescent protein (BFP) eller Green fluorescent protein (GFP). För att utveckla mer komplexa genetiska kretsar med flera komponenter krävs fler fluorescerande proteiner som kan kombineras med BFP och GFP, såsom sådana i det röda spektrumet. I denna studie undersöktes rödfluorescerade proteinerna E2Crimson, TagRFP657, mNeptune2.5, mKelly2, mKate2, mCardinal och Katushka2S. Med hjälp av klonade vektorer för respektive protein kan lentivirus produceras för att transducera Jurkat celler. Flödescytometri användes för att identifiera proteinernas fluorescensintensitet i det röda spektrumet, samt deras läckage i BFP och GFP spektrat. Proteinerna med högst fluorescensintensitet i det röda spektrumet samt minst läckage i BFP och GFP spektrat var E2Crimson samt mCardinal. E2Crimson har enligt tidigare studie låg toxicitet och god ljusstyrka samt hade i denna studie högst fluorescensintensitet i det röda spektrumet. E2Crimson anses därför vara optimal att kombinera med BFP och GFP i genetiska kretsar med flera komponenter. / Fluorescent protein can be used as reporters in genetic circuits to identify successfully modified cells. Using synthetic biology, genetic circuits, which are an assembly of genes that code for protein, can be created. Genetic circuits enable the modification of cells and have had great success in immunotherapy of cancer. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are a genetic circuit which modifies T cells to eliminate tumor cells based on a selected surface marker. With the help of the fluorescent protein, various components of genetic circuits can be marked and thus followed during the modification of cells, Blue fluorescent protein (BFP) or Green fluorescent protein (GFP) are often used as reporters. When developing complex genetic circuits with multiple components more fluorescent proteins that can combine with BFP and GFP are required, such as those in the red spectrum. In this study, the far-red fluorescent proteins E2Crimson, TagRFP657, mNeptune2.5, mKelly2, mKate2, mCardinal and Katushka2S were included. Using cloned vectors for each protein, lentiviruses can be produced to transduce Jurkat cells. Flow cytometry was used to identify the proteins fluorescence intensity in the red spectrum, as well as their leakage in the BFP and GFP spectra. The proteins with the highest fluorescence intensity in the red spectrum and the least leakage in the BFP and GFP spectra were E2Crimson and mCardinal. E2Crimson has according to other studies low toxicity and good brightness and in this study E2Crimson showed the highest fluorescence intensity in the red spectrum. E2Crimson is therefore considered optimal to combine with BFP and GFP in multicomponent genetic circuits.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:mau-60945 |
| Date | January 2021 |
| Creators | Persson, Caroline |
| Publisher | Malmö universitet, Fakulteten för hälsa och samhälle (HS) |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | Swedish |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0019 seconds