Fluorescerande protein kan användas som reportrar i genetiska kretsar för att identifiera framgångsrikt modifierade celler. Med hjälp av syntetisk biologi kan genetiska kretsar, som är en sammansättning gener som kodar för protein, skapas. Genetiska kretsar möjliggör modifiering av celler och har haft stor framgång, vid immunterapi av cancer. Chimeric antigen receptor (CAR) T-celler är en genetisk krets där T-celler modifieras till att eliminera tumörceller baserat på en utvald ytmarkör. Med hjälp av fluorescerande proteiner kan olika komponenter i genetiska kretsar märkas in och därmed tydligt följas vid modifieringen av celler, ofta används Blue fluorescent protein (BFP) eller Green fluorescent protein (GFP). För att utveckla mer komplexa genetiska kretsar med flera komponenter krävs fler fluorescerande proteiner som kan kombineras med BFP och GFP, såsom sådana i det röda spektrumet. I denna studie undersöktes rödfluorescerade proteinerna E2Crimson, TagRFP657, mNeptune2.5, mKelly2, mKate2, mCardinal och Katushka2S. Med hjälp av klonade vektorer för respektive protein kan lentivirus produceras för att transducera Jurkat celler. Flödescytometri användes för att identifiera proteinernas fluorescensintensitet i det röda spektrumet, samt deras läckage i BFP och GFP spektrat. Proteinerna med högst fluorescensintensitet i det röda spektrumet samt minst läckage i BFP och GFP spektrat var E2Crimson samt mCardinal. E2Crimson har enligt tidigare studie låg toxicitet och god ljusstyrka samt hade i denna studie högst fluorescensintensitet i det röda spektrumet. E2Crimson anses därför vara optimal att kombinera med BFP och GFP i genetiska kretsar med flera komponenter. / Fluorescent protein can be used as reporters in genetic circuits to identify successfully modified cells. Using synthetic biology, genetic circuits, which are an assembly of genes that code for protein, can be created. Genetic circuits enable the modification of cells and have had great success in immunotherapy of cancer. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are a genetic circuit which modifies T cells to eliminate tumor cells based on a selected surface marker. With the help of the fluorescent protein, various components of genetic circuits can be marked and thus followed during the modification of cells, Blue fluorescent protein (BFP) or Green fluorescent protein (GFP) are often used as reporters. When developing complex genetic circuits with multiple components more fluorescent proteins that can combine with BFP and GFP are required, such as those in the red spectrum. In this study, the far-red fluorescent proteins E2Crimson, TagRFP657, mNeptune2.5, mKelly2, mKate2, mCardinal and Katushka2S were included. Using cloned vectors for each protein, lentiviruses can be produced to transduce Jurkat cells. Flow cytometry was used to identify the proteins fluorescence intensity in the red spectrum, as well as their leakage in the BFP and GFP spectra. The proteins with the highest fluorescence intensity in the red spectrum and the least leakage in the BFP and GFP spectra were E2Crimson and mCardinal. E2Crimson has according to other studies low toxicity and good brightness and in this study E2Crimson showed the highest fluorescence intensity in the red spectrum. E2Crimson is therefore considered optimal to combine with BFP and GFP in multicomponent genetic circuits.

This thesis report revolved around the cloning process of plasmids. Attempts of cloning the red fluorescent protein mCherry, and the green fluorescent protein EGFP from various plasmids, into other plasmids containing different cell-junction/cytoskeleton plasmids were made. These plasmids were first amplified using PCR, and then cloned using Gibson-Assembly, and then transfected into live HEK293T or MDCK-II cells. After the transfection, the cells were examined in a microscope. The results showed no signal or localization for the cloned plasmids in their respective corresponding channel, 561 nm for the red fluorescent protein mCherry or 488 nm for the green fluorescent protein EGFP. The step that went wrong was the PCR step in the cloning process, since the backbone vector was not successfully amplified. The reasons for this was either that the backbone vector was too long, the primers regions were to rich with Guanine and Cytoseine, or the primers being too long. / Den här tesen kretsade kring kloningsprocessen för plasmider. Det gjordes försök att från plasmider klona in det röda fluorescerande proteinet mCherry, samt det gröna fluorescerande proteinet EGFP in i andra plasmider som innehöll olika cell-junction proteiner. Både det fluorescerande fragmenten och plasmid-vektorerna innehållande cell-junction proteinerna amplifierades med PCR. Sedan gjordes Gibson-Assembly som var själva kloningsmetoden. Efter det transfekterades HEK293T, samt MDCK-II celler med lösningen från Gibson-Assembly kloningen. Dessa celler undersöktes sedan i mikroskop. Resultatet visade inga tydliga signaler varken i 561 nm kanalen (mCherry), eller i 488 nm kanalen (EGFP), vilket betyder att kloningen inte fungerade. Steget som gick fel var PCR-steget i själva kloningsprocessen, då plasmid-vektorerna inte amplifierades. Anledningen till detta var antingen att själva plasmid-vektorerna var för långa, primer regionerna hade för mycket Guanin och Cytosin, eller att alla primers själva var för långa.