L’assemblage et la propagation du Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) met en jeu des évènements moléculaires et cellulaires impliquant des interactions entre protéines virales et co-facteurs cellulaires, tels que les régulateurs du trafic vésiculaire des protéines. Le virus doit notamment échapper aux mécanismes de défense de l’hôte afin de se disséminer dans l’organisme. La protéine BST2 « Bone marrow STromal antigen 2 » (Tetherin/CD317/HM1.24) appartient à une famille de médiateurs de l’immunité intrinsèque de l’hôte : les facteurs de restriction. BST2 inhibe la libération des particules virales néo-formées en les séquestrant à la surface des cellules infectées. La protéine virale Vpu permet de lever cette restriction en excluant BST2 des zones de bourgeonnement viral. Les mécanismes exacts par lesquels Vpu contrecarre l’activité anti-virale de BST2 au site de bourgeonnement ne sont pas complètement élucidés, mais résultent d’une altération du trafic intra-cellulaire du facteur de restriction. Une caractérisation précise des fonctions cellulaires de BST2, encore mal définies, et des mécanismes moléculaires et cellulaires régulant cette protéine et son activité permettrait de mieux appréhender son rôle au cours de l’infection, ainsi que les mécanismes développés par Vpu pour contrecarrer son activité anti-virale. Dans cette optique, nous avons entrepris un crible protéomique dans le but d’identifier des co-facteurs cellulaires de BST2. Compte tenu de l’importance des machineries de régulation du trafic intra-cellulaire dans la biogenèse virale et les contre-mesures par lesquelles Vpu contrecarre BST2, nous nous sommes essentiellement focalisés sur deux protéines de la famille EHD (Eps15 Homology Domain) : EHD4 et EHD1, deux GTPases impliquées dans la régulation du trafic vésiculaire des protéines au niveau des endosomes précoces et de recyclage respectivement. EHD4 en particulier a précédemment été décrite comme étant un régulateur de la biogenèse de virions VIH-1 infectieux selon des modalités qui restent à définir. Les objectifs de mon projet de thèse ont été (i) d’analyser / valider le rôle d’EHD4 dans la régulation du trafic intra-cellulaire de BST2 en conditions non-infectieuses, (ii) d’évaluer le rôle d’EHD4 dans l’activité anti-virale de BST2 et son antagonisme par la protéine virale Vpu, et finalement (iii) de documenter la contribution des protéines EHD4 et EHD1 dans le de cycle de réplication du VIH-1. Nous avons pu montrer qu’EHD4 interagit avec BST2 et régule son trafic intra-cellulaire au niveau des endosomes précoces. La déplétion d’EHD4 induit une altération majeure du trafic de BST2, caractérisée par une rétention de BST2 au niveau des endosomes précoces, associée à un ralentissement de son adressage vers les compartiments de dégradation lysosomale. Dans un contexte infectieux, EHD4 ne semble pas requise pour la dégradation de BST2 induite par Vpu, ni pour l’antagonisme de son activité anti-virale par la protéine virale. Cependant, nous avons révélé une implication majeure d’EHD4 et d’EHD1 dans le cycle de réplication du VIH-1 : en effet, leur déplétion respective aboutit à un ralentissement drastique de la propagation virale. EHD4 et EHD1 favorisent le déroulement d’une étape précoce de l’infection antérieure à la rétro-transcription du génome virale dans la cellule nouvellement infectée. De plus, EHD4 et EHD1 contribuent à la biogenèse de virus infectieux : leur déplétion respective perturbe le trafic intra-cellulaire des constituants viraux, l’intégrité des zones de bourgeonnement viral et l’incorporation de la glycoprotéine d’enveloppe dans les virions nouvellement produits. Ces altérations se traduisent par une diminution de l’infectivité des virions produits en l’absence des protéines EHD4 et EHD1. / Assembly and egress of Human Immunodeficiency Virus (HIV) involve a highly orchestrated series of interactions between proteins encoded by the virus and cellular cofactors, such as regulators of intra-cellular vesicular trafficking. One key challenge for the virus is to overcome several levels of host defence mechanisms to propagate. The cellular protein BST2 (Bone marrow STromal cell antigen-2), also called Tetherin, was recently identified as a cellular restriction factor that retains viral particles at the surface of infected cells, thereby considerably reducing viral release. The accessory protein Vpu encoded by the HIV-1 counteracts this restriction by reducing BST2 expression at the viral budding sites. This process comes along with a diminished global expression of BST2 in the cells. The mechanisms underlying Vpu-mediated BST2 down-regulation at the viral budding sites are not fully understood. Studies performed in the laboratory, along with others published by international research groups, showed that this activity relies on interference with BST2’s intra-cellular trafficking. A deeper caraterization of BST2’s cellular functions and modes of regulation would allow for a better understanding of its role against HIV-1 infection and the viral countermeasures antagonizing its antiviral activity. To this aim, we performed a protemic screening in order to identify new BST2 cofactors. As HIV-1 hijacks the cellular machineries involved in the regulation of vesicular intra-cellular traffcking to promote virion biogenesis and BST2 antagonism, we focused our investigations on two hits belonging to the EHD family (Eps15 Homology Domain) : EHD4 and EHD1. Both proteins are GTPases that regulate the intra-cellular vesicular trafficking, respectively at early and recycling endosomes. EHD4 has previously been involved in the regulation of the biogenesis of infectious HIV-1 viral particles, the underlying mecanisms remaining unclear to date. The goals of the research project constituting my Ph.D were to (i) analyze / validate the implication of EHD4 in the regulation of BST2’s intra-cellular trafficking in a non-infectious context, (ii) decipher the role of EHD4 in the regulation of BST2’s antiviral activity and its Vpu-mediated antagonism, and (iii) assess the invovlment of EHD4 and EHD1 in the replication cycle of HIV-1. We showed here that EHD4 interacts with BST2 and regulates its intra-cellular trafficking at early endosomes in a non-infectious context. EHD4 depletion induces a major alteration of BST2 trafficking, as internalized BST2 seem to be retained at an early endosomal level and unefficiently targeted towards the lysosomal degradation pathway. In the context of HIV-1 infection, EHD4 does not seem to be required in the Vpu-mediated BST2 degradation, nor in the antagonism of BST2’s antiviral activity. Nevertheless, we unveiled a major involvment of both EHD4 and EHD1 in the HIV-1 replication cycle : their respective depletion leads to a severe impairment of viral propagation. EHD4 and EHD1 seem to facilitate an early step of the viral cycle prior to reverse transcription. Moreover, EHD4 and EHD1 participate in the biogenesis of infectious virions : their respective depletion alters the intra-cellular trafficking of viral components, the viral budding sites organization and the incorporation of the viral envelope glycoprotein into nascent particles. Thoses phenotypes combined result in a drastic decrease of the infectivity of virions produced in the absence of either EHD4 or EHD1.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016USPCB038 |
| Date | 28 June 2016 |
| Creators | Pacini, Grégory |
| Contributors | Sorbonne Paris Cité, Janvier, Katy |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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