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Previous issue date: 2017-06-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The donkeys (Equus asinus) are individuals historically relevant for the occupation of inhospitable
areas around the world, but they have been losing importance due to the modernization of urban
centers and the creation of traction and cultivation technologies. Due to this fact, many donkey breeds
are already extinct or passing through a rapid process of population decrease. Among these breeds,
the Northeast donkey, an endemic breed in Brazil, is highlighted. One of the strategies for
conservation is the use of biotechnologies that facilitate reproduction, such as the manipulation of
oocytes enclosed in preantral follicles (MOEPF) that maximize the availability of oocytes for in vitro
fertilization. The starting point for the use of this and other techniques are known reproductive
physiology details of this breed as the characteristics of their gametes. The objective of this study
was to estimate and to characterize the population of ovarian PFs derived from Northeast breed
donkeys. Twenty females aging 5.1 ± 3.2 years and weighing 105.2 ± 18.6 kg were used. Animals
were subjected to an ovariectomy procedure guided by laparoscopy for ovary collection. As the
equines, donkey ovaries presented a kidney form and their parenchymal zone were extracted, taking
the ovulation fossa as basis. Fragments of ovary were fixed in Carnoy, dehydrated in increasing
Ethanol concentrations (70 to 99%), clarified using xylene and finally included in histological
paraffin wax blocks. These blocks were serially sectioned on 7 μm slices at using a microtome. Every
120th slice was mounted on glass slides, stained with hematoxylin–eosin and read in inverted optical
microscope. PFs presenting visible oocyte nuclei were measured at using an ocular micrometer and
classified as primordial, primary or secondary. PFs were also classified and counted as
morphologically normal, when containing an oocyte with regular shape and uniform cytoplasm, and
organized layers of granulosa cells; or as degenerated, when the oocyte exhibited pycnotic nucleus
and/or ooplasm shrinkage, and occasionally, granulosa cell layers became disorganized, detached
from the basement membrane and/or included enlarged cells. The PF population was estimated by
using the formula: (number of follicles × number of sections × thickness of sections)/(number of
sections observed × range of oocyte nuclei diameter). The results allowed us to estimate a total
population of 21,135.3 ± 10,646.1 PFs per animal. From this population, 91.3% PFs were classified
as primordial, 8.2% PFs as primary, and 0.3% as secondary. multioocyte PFs were observed in all
animals, and they were more frequently present in primordial follicles, representing 0.99% of total
PFs counted. The estimated population was distributed between the right and left ovaries, at 54.6%
and 45.4%, respectively. Most PFs were considered morphologically normal (90.2%) and the
smallest, degenerate (9.8%). An inversely proportional relationship between age and follicular
population was identified, similarly to the relation between weight and follicular population. In the
second experiment, the ovarian tissue of animals from the same group was subjected to a vitrification
procedure using dimethylsulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) as cryoprotectants in separate
and associated. When comparing treatments, the use of DMSO 3M (81.7 ± 37.5%), EG 3M (83.7 ±
27.4%) and the combination of both DMSO 3M + EG 3M (81.8 ± 46.8%) allowed a greater
percentage of follicular survival. When vitrified using the DMSO + EG combination, a higher
percentage (62.5 ± 29.1%) of viable follicles was observed in relation to the other vitrification
treatments (P <0.05). The TUNEL technique identified that all treatments tested showed DNA
fragmentation in the follicular cells, except in the case of the DMSO 3M plus EG 3M treatment.
When evaluating the presence of NORs, no significant differences were observed in the amount of
NORs between the fresh and vitrified groups using DMSO 3M plus EG 3M (P >0.05). Thus, we
concluded that the combination DMSO 3M plus EG was more efficient for the vitrification of ovarian
tissue taken from Equus asinus, allowing adequate preservation of PAFS morphology, viability,
DNA integrity and cell proliferative capacity. This work presented for the first time the estimate of
ovarian preantral follicles in donkeys of the Northeastern breed and successful vitrification / Os jumentos (Equus asinus) são animais historicamente relevantes para a ocupação de áreas inóspitas
em todo o mundo, mas tem perdido espaço devido à modernização dos centros urbanos e a
mecanização agrícola e transporte motorizado. Assim, muitas raças de jumentos já foram extintas ou
encontram-se em rápido processo de queda populacional, e dentre elas está a raça Nordestina,
endêmica do Brasil. Uma das estratégias de conservação é o uso de biotecnologias que favoreçam a
reprodução assistida, como a manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA)
que maximiza a disponibilidade de oócitos para outras biotécnicas. O ponto de partida para o uso
desta e outras biotécnicas é conhecer detalhes da fisiologia reprodutiva e dos gametas da espécie ou
raça que se deseja manipular. O objetivo desta tese é caracterizar e conservar por meio da vitrificação
a população de folículos ovarinos pré-antrais (FP) em fêmeas asininas da raça Nordestina. No
primeiro experimento, dez fêmeas com idade média de 5,1 ± 3,2 anos e peso médio de 105,2 ± 18,6
kg, constituíram o grupo de estudo. As mesmas foram submetidas a procedimento de ovariectomia
guiada por laparoscopia para coleta dos ovários. Assim como nos demais equídeos, os ovários das
jumentas apresentam formato reniforme e suas zonas parenquimatosa, incluindo a fossa ovariana,
foram extraídas. Fragmentos do ovário foram fixados com carnoy, desidratados com etanol em
concentrações crescentes (70 a 99%), clarificados usando xilol e finalmente inclusos em blocos de
parafina histológica. Estes blocos foram sequencialmente seccionados em micrótomo em frações de
7μm. Uma a cada 120 frações foi montada em lâminas de vidro e corada com hematoxilina-eosina e
lida em microscópio ótico. Os FPs que apresentaram núcleo visível foram fotografados, mensurados
com uso de software e classificados como primordiais, primários e secundários. Os FPs classificados
e contados foram identificados como normais ou degenerados. A população de FPs foi estimada
usando a fórmula: (número de PF observados × número total de secções × espessura das secções)
dividido pelo (número de secções observadas × diâmetro médio do núcleo dos oócitos). A população
média estimada foi de 21.135,3 ± 10.646,1 FPs por animal. Destes, 91,3% foram identificados como
primordiais, 8,2% como folículos primários e 0,4% como secundários. Folículos com múltiplos
oócitos foram observados em todos os animais, todos classificados como primordiais, representando
0,99% do total de folículos. A população de PF estimada estava distribuída entre os ovários direito e
esquerdo, em 54,6% e 45,4% respectivamente. A maior parte dos PFs foi considerada
morfologicamente normal (90,2%) e a menor parcela, degenerados (9,8%). Foi identificada uma
relação inversamente proporcional entre a idade e a população folicular, semelhante à relação entre
peso e população folicular. No segundo experimento, o tecido ovariano de jumentas foram
submetidos a procedimento de vitrificação em superfície sólida usando dimetil sulfóxido (DMSO) e
etileno glicol (EG), isoladamente em diferentes concentrações (3M e 6M) e associados, como agentes
crioprotetores. Quando comparados aos tratamentos o uso do DMSO 3M (81,7 ± 37,5%), EG 3M
(83,7 ± 27,4%) e a combinação de DMSO 3M + EG 3M (81,8 ± 46,8%) apresentaram um grande
percentual de folículos morfologicamente normais. O uso do DMSO 3M + EG 3M, apresentou o
maior percentual (62,5 ± 29,1%) de folículos viáveis em relação aos demais tratamentos (P <0,05).
Pela técnica TUNEL, todos os tratamentos apresentaram fragmentação de DNA nas células
foliculares, exceto no caso do DMSO 3M + EG 3M. Quando avaliada a presença de NORs, não foi
verificada diferenças significativas entre o número de NORs no grupo controle e no tratamento
DMSO 3M + EG 3M (P < 0,05). A combinação DMSO 3M e EG 3M mostrou-se mais eficiente para
a vitrificação de tecido ovariano de jumentas, apresentando-se de forma adequada para a preservação
da morfologia e viabilidade de folículos pré antrais, bem como a integridade do DNA e a capacidade
de proliferação celular. Este trabalho apresentou de forma inédita a estimativa de folículos pré-antrais
ovarianos em jumentas da raça nordestina bem como uma estratégia de criopreservação com
resultados positivos / 2017-08-21
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:bdtd.ufersa.edu.br:tede/795 |
| Date | 30 June 2017 |
| Creators | Lopes, Katia Regina Freire |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/0516971232838494, Silva, Alexandre Rodrigues, Lima, Gabriela Liberalino, Pereira, Alexsandra Fernandes, Saraiva, Márcia Viviane Alves, Luz, Marcelo Rezende |
| Publisher | Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, UFERSA, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFERSA, instname:Universidade Federal Rural do Semi-Árido, instacron:UFERSA |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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