Células tronco embrionárias (CTE) são capazes de proliferar indefinidamente mantendo a sua pluripotência, isto é, a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares perante estímulos adequados. Esse potencial tem sido intensamente estudado, de modo a permitir a utilização dessas células em terapias de reposição celular. Trabalhos anteriores demonstraram que as proteínas kinases C (PKC) são importantes moduladores moleculares de cascatas de sinalização que levam ao processo de proliferação e auto-renovação das CTE. Porém o papel exato das diferentes isoenzimas das PKCs ainda não foi elucidado. Isso ocorre porque a família das PKCs é composta por pelo menos dez isoenzimas e apenas, recentemente, desenvolveram-se moduladores específicos para as diferentes isoenzimas, o que permitirá estudar o papel específico dessas quinases. No presente trabalho verificamos que a ativação da PKCδ induziu a proliferação de CTE indiferenciadas sem induzir a diferenciação das mesmas. Para tentar elucidar as vias de sinalização mediadas pela PKCδ que levam à proliferação das CTE indiferenciadas realizamos estudos de fosfoproteômica o que possibilitou a identificação de potenciais alvos diretos e indiretos da PKCδ. Dentre os alvos identificados foram encontradas diversas proteínas relacionadas com proliferação, transcrição, tradução e resposta ao stress (chaperonas), contribuindo para a hipótese de que a ativação da PKCδ leva à proliferação das CTE indiferenciadas. Em diversos sistemas, a ativação da PKCδ leva à ativação da MAPK, em particular das ERK1/ 2, sendo essa via capaz de induzir a proliferação de diversas linhagens celulares. Identificamos diversas proteínas alvos da PKCδ, que interagem também com componentes da via das MAPKs. Desta forma, verificamos a influência da ativação da PKCδ na via das MAPKs. De fato, a ativação da PKCδ na linhagem de CTE murinas indiferenciadas, E14TG2a, ativou a MEK, ERK1/ 2 e o fator de transcrição ELK-1. Como estudos anteriores demonstraram que a inibição da ERK1/ 2 mantém CTE indiferenciadas e que a ativação desta via poderia levar à diferenciação de CTE, investigamos a cinética de ativação da ERK pela PKCδ. Demonstramos que a ativação da ERK pela PKCδ se da de modo transiente e que apesar da PKCδ não translocar para o núcleo, sua ativação induz a fosforilação e translocação nuclear da ERK, que atuará na fosforilação do fator de transcrição ELK-1. Desta forma, concluímos que a PKCδ induz a proliferação das CTE murinas indiferenciadas ativando transitoriamente a via das ERK1/ 2, que translocam para o núcleo fosforilando fatores de transcrição como a ELK1 e levando possivelmente ao aumento de proliferação dessas células. A ativação transiente das ERK1/ 2 pela PKCδ é importante para a auto-renovação das CTE. / Embryonic stem cells (ESC) are able of proliferating indefinitely maintaining their pluripotency, which is the capability to differentiate in different cell types upon appropriate stimuli. Pluripotency has been intensely investigated in order to allow the use of these cells in cellular replacement therapies. Previous work has demonstrated that the serine/ threonine kinases, such as, Protein kinases C (PKC) are important modulators of signaling cascades that lead to the process of proliferation and self-renewal of ESC. However, the exact role of the different PKC isoenzymes still remains to be elucidated. Due to the fact that the PKC family is composed of at least ten different isoenzymes and only recently isoenzyme specific modulators have been developed, which now allows the elucidation of these kinases roles. In the present work we verified that activation of PKCδ induced undifferentiated ESC have their proliferation rate increased. Trying to elucidate the signaling pathways mediated by PKCδ that lead to the proliferation increase we performed phosphoproteomic studies to identify potential PKCδ targets. Between the targets identified we found several proteins related with proliferation, protein transcription, translation and stress response (chaperones). These targets contributed to the hypothesis that PKCδ activation leads to undifferentiated ESC proliferation. In different cell lines, PKCδ activation leads to MAPK activation, through ERK1/ 2 activation, which are frequently involved with cellular proliferation. We also identified several targets of PKCδ that Interact with several components of MAPK`s signaling cascade. PKCδ activation in murine undifferentiated ESC line, E14TG2a, led to MEK, ERK1/ 2 and the transcription factor Elk-1 activation. Some articles demonstrate that the inhibition of ERK1/2 are responsible to maintains ESC undifferentiated and that it`s activation could lead to ESC differentiation. Analysing the kinetics of ERK activation in the ESC by PKCδ, we show that ERK activation was transient and despite the fact that PKCδ does not translocated to the nucleus upon activation, but induces ERK activation and it`s nuclear translocation, where ERK could phosphorylate the transcription factor Elk-1. In conclusion PKCδ induces undifferentiated murine ESC proliferation increase by a transient ERK activation and it`s nuclear translocation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-13102011-082406 |
| Date | 04 August 2011 |
| Creators | Garavello, Nicole Milaré |
| Contributors | Schechtman, Deborah |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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