A cana-de-açúcar constitui uma das principais fontes de alimento e de energia renovável no mundo. Entre os fatores bióticos que reduzem sua produtividade, destaca-se o carvão, doença causada pelo fungo biotrófico Sporisorium scitamineum, cujos danos à cultura podem ultrapassar 80%. No entanto, poucos estudos foram desenvolvidos sobre a genética desse patógeno. Assim, o presente trabalho estudou a dinâmica de marcas RFLP associados à região subtelomérica (tel-RFLP) e marcas GFP em três populações do patógeno (a, b e c) obtidas em ciclos sucessivos da doença. A população a inicialmente foi formada pela inoculação com teliósporos F1 oriundos do isolado 39 produzido em trabalho anterior (REIS, 2012). As populações b e c foram produzidas inicialmente por cruzamentos controlados. Estes envolveram como parentais esporídios haploides de tipos de reação sexual compatíveis e perfis tel-RFLP conhecidos. Na população b os esporídios parentais (18A e 39B) foram isolados de teliósporos distintos, apresentaram perfis tel-RFLP mais contrastantes e simularam fecundação cruzada. Na população c, os esporídios parentais 39Agfp e 39Bgfp apresentaram perfis tel- RFLP mais semelhantes. Esses mutantes foram obtidos pela inserção heteróloga do gene gfp em esporídios obtidos de um único teliósporo simulando autofecundação (reação sexual intra-tétrade). A comparação entre os perfis de tel-RFLP dos esporídios selvagens e mutantes GFP detectou a inserção do gene gfp possivelmente na região subtelomérica do individuo 39Agfp (parental). A cada ciclo da doença teliósporos selvagens e mutantes GFP foram obtidos, sendo isolados dois esporídios para os cruzamentos controlados que levaram à produção do ciclo seguinte de doença. O uso de cruzamentos controlados possibilitou a produção de teliósporos idênticos geneticamente, permitindo inferir sobre eventos meióticos ocorrentes numa mesma progênie. A fenotipagem sexual dos esporídios que tiveram os perfis de tel-RFLP analisados reduziu o viés advindo do desvio da segregação esperada de 1:1 entre os tipos sexuais de esporídios pertencentes à mesma divisão meiótica. Além disso, auxiliou na detecção de recombinantes, visto que os loci de reação sexual segregam na meiose I. A análise das marcas tel-RFLP das progênies mutantes GFP e selvagens, obtida respectivamente em 1 e 2 ciclos da doença, evidenciou eventos de recombinação na segregação de cromossomos homólogos e eventos de recombinação homóloga. Mesmo apresentando número elevado, as marcas tel-RFLP foram capazes de rastrear indivíduos pertencentes a uma mesma população, o que poderá auxiliar em futuras avaliações epidemiológicas do carvão da cana-de-açúcar. Por fim, a expressão do gene gfp em células de pró-basídios mutantes possibilitou a detecção de recombinação homóloga associada a essa marca e a observação inédita de tétrades lineares de quatro células para essa espécie. Observou-se elevado potencial de utilização do gene gfp em estudos genéticos aplicados a esse patossistema. A recombinação sugerida na região subtelomérica mostrou frequência de recombinação ainda não descrita para essa espécie a ser estudada posteriormente. / Sugarcane is a major source of food and renewable energy in the world. Among the biotic factors that reduce its productivity we highlight the sugarcane smut disease, caused by the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum, whose damages to the crop can overpass 80%. However, few genetic studies have targeted this pathogen. Thus, the present work studied the dynamics of RFLP marks associated to the subtelomeric region (tel-RFLP) and GFP marks of three populations of the pathogen (a, b and c) obtained from consecutive disease cycles. Population a was initially formed with inoculation using teliospores F1 from the whip 39 obtained in previous work (REIS, 2012). Populations b and c were initially produced by controlled crosses of sexual compatible haploid sporidia with known tel-RFLP profiles as parents. In population b the parent sporidia (18A and 39B) were isolated from distinct teliospores, had more different tel-RFLP profiles (7 polymorphic marks) and simulated outcrossing. In population c, the parental sporidia 39Agfp and 39Bgfp had more similar tel-RFLP profiles. These mutants were obtained by heterologous insertion of gfp gene in sporidia obtained from single teliospore, simulating selfing (intra-tetrad mating type). The comparison between wild-type and GFP mutant sporidia tel-RFLP profiles had detected the gfp gene insertion in the subtelomeric region of the individual 39Agfp (parent). For each disease cycle wild-type and GFP mutant teliospores were obtained and two sporidia were isolated to perform controlled crosses that lead to the next disease cycle. The use of controlled crosses resulted in the production of genetically identical teliospores, which allowed inferring about same progeny meiotic occurring events. The sexual phenotyping of the sporidia that had their tel-RFLP analyzed reduced the bias resulted from deviation of expected 1:1 ratio segregation among the mating types of same meiotic division progeny. Besides, it helped in the recombinants detection, due to mating type loci segregation in meiosis I. The analysis of wild-type and GFP mutant progenies tel- RFLP marks, obtained for 2 and 1 disease cycles, has pointed out events of homologous chromosomes recombination and crossing-over events. Despite of the high amount of marks obtained, the tel-RFLP marks allowed the tracking of individuals from the same population, which can benefit future sugarcane smut disease epidemiologic evaluations. Moreover, the gfp gene expression of mutant probasidium cells led to the detection of crossing-over involving the GFP mark and the first observation of linear four-cells tetrads to this species. A high potential use of gfp gene in genetic studies applied to this pathosystem was observed. The recombination suggested for the subtelomeric region showed a recombination frequency haven\'t described for this species that needs to be further studied.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-05012015-172549 |
| Date | 06 November 2014 |
| Creators | Longatto, Daniel Prezotto |
| Contributors | Vitorello, Claudia Barros Monteiro |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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