O fungo Sporisorium scitamineum é o agente causador de uma das doenças mais importantes da cultura da cana-de-açúcar, o carvão da cana, e vem sendo alvo de diversos estudos genéticos para a elucidação de seu mecanismo de patogenicidade e interação com o seu hospedeiro. Dentre esses estudos há os que visam acessar a variabilidade genética entre isolados desse fungo utilizando diversos marcadores moleculares, porém todos os experimentos indicaram baixa variabilidade, com exceção de isolados provenientes da Ásia. O primeiro estudo realizado com esse intuito em isolados brasileiros utilizou o tel-RFLP e AFLP, obtendo uma variabilidade de 34 e 3%, respectivamente. O AFLP é muito utilizado para a detecção de variação genética em indivíduos próximos, porém, nesse caso, apresentou baixa variação, o que nos levou a caracterizar, no presente trabalho, os poucos polimorfismos encontrados através dessa técnica. Os fragmentos polimórficos foram reamplificados, sequenciados e caracterizados quanto ao seu contexto genômico. Como essas sequências estão dispersas ao longo do genoma e geralmente estão em regiões intergênicas, foi feita a análise de expressão dos genes vizinhos a esses polimorfismos em três condições distintas. Desses genes, 70% apresentaram maior número de reads mapeadas in planta que em meio de cultura, indicando que são mais importantes durante a interação planta-patógeno. Dessa forma, mesmo havendo uma baixa variabilidade detectada por AFLP, essas diferenças podem ser importantes na regulação desses genes, podendo influenciar na agressividade do patógeno e na sua defesa. / The fungi Sporisorium scitamineum is the causal agent of one of the most important diseases in sugarcane, the sugarcane smut, and it has been the target of several genetic studies aiming the elucidation of pathogenicity and host interaction macanisms. Among these studies are those that aim to access the genetic variability among isolates of this fungus using various molecular markers techniques, however in all of them the experiments indicated low variability, with exception of the Asian isolates. The first work performed with Brazilian isolates was done using tel-RFLP and AFLP, and detected a variability of 34 and 3%, respectively. The AFLP is widely used to detect variability in close related individuals, but in this case, the method revealed low polimorphism. These results led us to characterize in the present work the few polymorphisms detected. The polymorphic fragments were isoladed, reamplified, sequenced and in silico characterized regarding the genomic context. Since these sequences are disperse along the genome and generally they are in intergenic regions, an expression analysis of the polymorfisms neighbor genes was made at three different conditions. Of these genes, 70% presented higher numbers of maped reads in planta than in culture media, which indicates that they are important during the plant-pathogen interaction. Thus, even with low variability detected via AFLP, these differences can be important in the gene regulation and may influence in the pathogen agressivity and in its defense.

Sporisorium scitamineum é um fungo basidiomiceto causador do carvão da cana-de-açúcar, uma doença com impacto negativo no cultivo da cana-de-açúcar, e com ocorrência em todos os países produtores. A manifestação da doença na cultura da cana depende da formação de uma hifa dicariótica a partir da anastomose de duas hifas haplóides compatíveis com relação ao tipo de reação sexual (mating-type). O controle do cruzamento sexuado (mating) é realizado pela expressão de um conjunto de genes presentes em dois loci, a e b. O locus a codifica um lipopeptídeo com função de feromônio e um receptor de feromônio, responsáveis pelo reconhecimento de células compatíveis e fusão de hifas, enquanto o locus b codifica fatores de transcrição que controlam a expressão de genes responsáveis pela manutenção das hifas dicarióticas durante o processo de infecção e crescimento do fungo dentro da planta. Apesar de desempenharem função essencial no processo de infecção e manutenção da doença em cana-de-açúcar, o conhecimento a respeito da organização genômica ou da função dos demais genes presentes nos loci a e b em S. scitamineum e em outros fungos causadores de carvão é ainda incipiente. Desta forma, o objetivo geral do presente trabalho foi isolar as regiões genômicas relacionadas aos genes de cruzamento em S. scitamineum e analisar comparativamente com regiões similares já descritas e depositadas em bancos de dados públicos. Para o isolamento destas regiões, foi construída uma biblioteca genômica em BAC de uma linhagem haplóide de S. scitamineum, a Ssc39 (+), isolada de uma variedade de cana-de-açúcar com sintomas de alta susceptibilidade. Foram selecionados 11 clones por PCR. Os insertos foram sequenciados e utilizados para confirmação da montagem dos loci no sequenciamento do genoma do fungo. Apesar do fungo S. scitamineum apresentar sistema bipolar de reação sexual assim como o fungo U. hordei, as análises comparativas de ambos os locus indicaram que S. scitamineum apresenta maior similaridade com o fungo S. reilianum principalmente com o alelo a1, no qual apresenta sistema tetrapolar de reação sexual. A anotação e caracterização dos genes do tipo de reação sexual (mating type) possibilitaram a comparação e melhor entendimento sobre esses genes de grande importância na patogenicidade e no ciclo de vida do fungo. / Sporisorium scitamineum is a basidiomycete fungus causing the smut disease in sugarcane, with a negative impact on the cultivation of sugarcane, and occurring in all producing countries. The manifestation of the disease in sugarcane crop depends on the formation of a dikaryotic hyphae originated of the anastomosis of two haploid mating type compatible cells. The control of the sexual crossing (mating) is performed by expression of a set of genes present in two loci, a and b. The locus a encodes a lipopeptide with the function of pheromone and pheromone membrane receptor responsible for cell recognition and compatible hyphal fusion, whereas the locus b encodes transcription factors that control the expression of genes responsible for the maintenance of the dikaryotic hyphal growth in plant. Although they play an essential role in the maintenance of infection and disease in sugarcane process, knowledge about the genomic organization and function of other genes in these two loci of S. scitamineum and other smut fungi is still incipient. Thus, the overall goal of this work was to isolate genomic regions related to the mating type in S. scitamineum and to perform a comparative analyze with similar regions described and deposited in public databases. For the isolation of these regions, we constructed a genomic BAC library of a haploid strain of S. scitamineum, the Ssc39 (+), isolated from a variety of sugarcane with symptoms of high susceptibility. Eleven clones were selected by PCR. The inserts were sequenced and used to confirm the assembly of both loci in the genome sequencing of the fungus. Although S. scitamineum belongs to the class of bipolar system of sexual response as well as the fungus U. hordei , the comparative analysis of both loci indicated that S. scitamineum shows greater similarity to the S. reilianum mainly with A1 allele, which has a tetrapolar system sexual response. The annotation of the genes and characterization mating type genes enabled the comparison and better understanding of the importance of these genes in the life cycle of the fungus.

Sporisorium scitamineum é um fungo basidiomiceto causador do carvão da cana-de-açúcar, uma doença com impacto negativo no cultivo da cana-de-açúcar, e com ocorrência em todos os países produtores. A manifestação da doença na cultura da cana depende da formação de uma hifa dicariótica a partir da anastomose de duas hifas haplóides compatíveis com relação ao tipo de reação sexual (mating-type). O controle do cruzamento sexuado (mating) é realizado pela expressão de um conjunto de genes presentes em dois loci, a e b. O locus a codifica um lipopeptídeo com função de feromônio e um receptor de feromônio, responsáveis pelo reconhecimento de células compatíveis e fusão de hifas, enquanto o locus b codifica fatores de transcrição que controlam a expressão de genes responsáveis pela manutenção das hifas dicarióticas durante o processo de infecção e crescimento do fungo dentro da planta. Apesar de desempenharem função essencial no processo de infecção e manutenção da doença em cana-de-açúcar, o conhecimento a respeito da organização genômica ou da função dos demais genes presentes nos loci a e b em S. scitamineum e em outros fungos causadores de carvão é ainda incipiente. Desta forma, o objetivo geral do presente trabalho foi isolar as regiões genômicas relacionadas aos genes de cruzamento em S. scitamineum e analisar comparativamente com regiões similares já descritas e depositadas em bancos de dados públicos. Para o isolamento destas regiões, foi construída uma biblioteca genômica em BAC de uma linhagem haplóide de S. scitamineum, a Ssc39 (+), isolada de uma variedade de cana-de-açúcar com sintomas de alta susceptibilidade. Foram selecionados 11 clones por PCR. Os insertos foram sequenciados e utilizados para confirmação da montagem dos loci no sequenciamento do genoma do fungo. Apesar do fungo S. scitamineum apresentar sistema bipolar de reação sexual assim como o fungo U. hordei, as análises comparativas de ambos os locus indicaram que S. scitamineum apresenta maior similaridade com o fungo S. reilianum principalmente com o alelo a1, no qual apresenta sistema tetrapolar de reação sexual. A anotação e caracterização dos genes do tipo de reação sexual (mating type) possibilitaram a comparação e melhor entendimento sobre esses genes de grande importância na patogenicidade e no ciclo de vida do fungo. / Sporisorium scitamineum is a basidiomycete fungus causing the smut disease in sugarcane, with a negative impact on the cultivation of sugarcane, and occurring in all producing countries. The manifestation of the disease in sugarcane crop depends on the formation of a dikaryotic hyphae originated of the anastomosis of two haploid mating type compatible cells. The control of the sexual crossing (mating) is performed by expression of a set of genes present in two loci, a and b. The locus a encodes a lipopeptide with the function of pheromone and pheromone membrane receptor responsible for cell recognition and compatible hyphal fusion, whereas the locus b encodes transcription factors that control the expression of genes responsible for the maintenance of the dikaryotic hyphal growth in plant. Although they play an essential role in the maintenance of infection and disease in sugarcane process, knowledge about the genomic organization and function of other genes in these two loci of S. scitamineum and other smut fungi is still incipient. Thus, the overall goal of this work was to isolate genomic regions related to the mating type in S. scitamineum and to perform a comparative analyze with similar regions described and deposited in public databases. For the isolation of these regions, we constructed a genomic BAC library of a haploid strain of S. scitamineum, the Ssc39 (+), isolated from a variety of sugarcane with symptoms of high susceptibility. Eleven clones were selected by PCR. The inserts were sequenced and used to confirm the assembly of both loci in the genome sequencing of the fungus. Although S. scitamineum belongs to the class of bipolar system of sexual response as well as the fungus U. hordei , the comparative analysis of both loci indicated that S. scitamineum shows greater similarity to the S. reilianum mainly with A1 allele, which has a tetrapolar system sexual response. The annotation of the genes and characterization mating type genes enabled the comparison and better understanding of the importance of these genes in the life cycle of the fungus.

O fungo Sporisorium scitamineum é o agente causador de uma das doenças mais importantes da cultura da cana-de-açúcar, o carvão da cana, e vem sendo alvo de diversos estudos genéticos para a elucidação de seu mecanismo de patogenicidade e interação com o seu hospedeiro. Dentre esses estudos há os que visam acessar a variabilidade genética entre isolados desse fungo utilizando diversos marcadores moleculares, porém todos os experimentos indicaram baixa variabilidade, com exceção de isolados provenientes da Ásia. O primeiro estudo realizado com esse intuito em isolados brasileiros utilizou o tel-RFLP e AFLP, obtendo uma variabilidade de 34 e 3%, respectivamente. O AFLP é muito utilizado para a detecção de variação genética em indivíduos próximos, porém, nesse caso, apresentou baixa variação, o que nos levou a caracterizar, no presente trabalho, os poucos polimorfismos encontrados através dessa técnica. Os fragmentos polimórficos foram reamplificados, sequenciados e caracterizados quanto ao seu contexto genômico. Como essas sequências estão dispersas ao longo do genoma e geralmente estão em regiões intergênicas, foi feita a análise de expressão dos genes vizinhos a esses polimorfismos em três condições distintas. Desses genes, 70% apresentaram maior número de reads mapeadas in planta que em meio de cultura, indicando que são mais importantes durante a interação planta-patógeno. Dessa forma, mesmo havendo uma baixa variabilidade detectada por AFLP, essas diferenças podem ser importantes na regulação desses genes, podendo influenciar na agressividade do patógeno e na sua defesa. / The fungi Sporisorium scitamineum is the causal agent of one of the most important diseases in sugarcane, the sugarcane smut, and it has been the target of several genetic studies aiming the elucidation of pathogenicity and host interaction macanisms. Among these studies are those that aim to access the genetic variability among isolates of this fungus using various molecular markers techniques, however in all of them the experiments indicated low variability, with exception of the Asian isolates. The first work performed with Brazilian isolates was done using tel-RFLP and AFLP, and detected a variability of 34 and 3%, respectively. The AFLP is widely used to detect variability in close related individuals, but in this case, the method revealed low polimorphism. These results led us to characterize in the present work the few polymorphisms detected. The polymorphic fragments were isoladed, reamplified, sequenced and in silico characterized regarding the genomic context. Since these sequences are disperse along the genome and generally they are in intergenic regions, an expression analysis of the polymorfisms neighbor genes was made at three different conditions. Of these genes, 70% presented higher numbers of maped reads in planta than in culture media, which indicates that they are important during the plant-pathogen interaction. Thus, even with low variability detected via AFLP, these differences can be important in the gene regulation and may influence in the pathogen agressivity and in its defense.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura agrícola, sendo hospedeira de vários patógenos, incluindo o fungo biotrófico Sporisorium scitamineum, agente causal do carvão. A doença reduz a produtividade das lavouras de cana e a qualidade de seus produtos, sendo reconhecida pelo desenvolvimento de uma estrutura em forma de chicote, onde os teliósporos são produzidos. O objetivo deste estudo foi analisar o transcritoma da interação cana-de-açúcar - S. scitamineum, visando a identificação de genes do hospedeiro diferencialmente expressos em resposta à infecção fúngica. Gemas da variedade tolerante \'RB92-5345\' foram inoculadas com S. scitamineum e mantidas em casa de vegetação para a coleta das amostras, em dois momentos: 120 h após a inoculação, e no momento da emissão do chicote, aos 200 dias após a inoculação. Foram construídas 12 bibliotecas com base na abordagem RNAseq. Três estratégias computacionais foram utilizadas nas etapas de mapeamento e análise da expressão diferencial de genes da cana: (i) STAR e DESeq, tomando como referência o genoma do sorgo; (ii) Bowtie 2 e DESeq, e (iii) CLC Genomics Workbench, tomando como referência as sequências codificadoras (CDS) do sorgo. Diagramas de Venn foram construídos para identificar genes diferencialmente expressos comuns às três estratégias computacionais, aumentando a acurácia das análises. Para a anotação, foi usada a ferramenta BLAST2GO. Foram obtidos 225 milhões de reads; dentre os 185 milhões usados no mapeamento, 66% foram mapeados em genes e 51% nas CDS. Aproximadamente 77% dos genes e 87% das CDS mapeados apresentaram atividade transcricional (pelo menos um read mapeado), sob as condições do experimento, em ambos os momentos da interação. Um total de 596 e 2.148 genes diferencialmente expressos foram identificados nas respostas iniciais e tardias à infecção, respectivamente; para 79% deles foi possível atribuir uma função. Pelas intersecções, 41 (resposta inicial) e 206 (resposta tardia) genes foram comuns às três estratégias. Sugere-se que a planta percebe o patógeno no início da interação, porém o fungo é capaz de suprimir a resposta de defesa vegetal. Propõe-se que há uma reprogramação da expressão gênica defesa-orientada, favorecendo o desenvolvimento da planta, mesmo com a doença instalada. A expressão de genes relacionados à resistência, às vias de hormônios e com a formação da parede celular (além de inibidores de proteínas fúngicas) sugerem que a planta se empenha drasticamente para sobreviver após 200 dias de interação. Decifrando os perfis do transcritoma da cana na interação com S. scitamineum, este trabalho deve contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos de resistência ao carvão. / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop, and hosts several pathogens, including the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum, the causal agent of smut. The disease reduces the sugarcane crop yield and the quality of its products, and is recognized by the development of a whip-like structure, where teliospores are produced. The objective of this study was to analyze the transcriptome of sugarcane - S. scitamineum interaction and to identify differentially expressed genes from the host in response to fungal infection. Buds of the tolerant variety \'RB92-5345\' were inoculated with S. scitamineum and maintained in a greenhouse for two sampling interaction moments: 120 h after inoculation, and at the moment of the whip emission, 200 days after inoculation. Twelve libraries were constructed based on RNAseq approach. Three computational strategies were used in the mapping step and differential expression analysis of sugarcane genes: (i) STAR and DESeq, using as reference the sorghum genome; (ii) Bowtie 2 and DESeq, and (iii) CLC Genomics Workbench, using as reference the coding sequences (CDS) from sorghum. Venn diagrams were created to identify differential expressed genes that were common to the three computational strategies, thus increasing the analysis accuracy. For annotation, the BLAST2GO tool was used. We have obtained 225 million reads; out of the 185 million reads used for mapping, 66% were mapped to genes and 51% to CDS. Approximately 77% and 87% of the mapped genes and CDS respectively showed transcriptional activity (at least one read was mapped) under the experimental conditions at both interaction moments. A total of 596 and 2,148 differentially expressed genes were identified at early and late responses to the infection, respectively; it was possible to attribute function to 79% of them. Through intersectioning, 41 (early response) and 206 (late response) genes were found to be common to the three strategies. It is suggested that the plant recognizes the pathogen at the beginning of interaction period, though the fungal is able to suppress the host defense response. It is also proposed that a defense-oriented transcriptional reprogramming takes place, supporting plant development even with the disease setting. The expression of genes related to resistance, hormone pathways, and cell wall formation (as well as inhibitors of fungal proteins) suggests that the plant makes exceptional efforts to survive after 200 days of interaction. Deciphering the sugarcane transcriptome profile during the interaction with S. scitamineum, this study should contribute to a better understanding of the resistance mechanisms to the smut.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura agrícola, sendo hospedeira de vários patógenos, incluindo o fungo biotrófico Sporisorium scitamineum, agente causal do carvão. A doença reduz a produtividade das lavouras de cana e a qualidade de seus produtos, sendo reconhecida pelo desenvolvimento de uma estrutura em forma de chicote, onde os teliósporos são produzidos. O objetivo deste estudo foi analisar o transcritoma da interação cana-de-açúcar - S. scitamineum, visando a identificação de genes do hospedeiro diferencialmente expressos em resposta à infecção fúngica. Gemas da variedade tolerante \'RB92-5345\' foram inoculadas com S. scitamineum e mantidas em casa de vegetação para a coleta das amostras, em dois momentos: 120 h após a inoculação, e no momento da emissão do chicote, aos 200 dias após a inoculação. Foram construídas 12 bibliotecas com base na abordagem RNAseq. Três estratégias computacionais foram utilizadas nas etapas de mapeamento e análise da expressão diferencial de genes da cana: (i) STAR e DESeq, tomando como referência o genoma do sorgo; (ii) Bowtie 2 e DESeq, e (iii) CLC Genomics Workbench, tomando como referência as sequências codificadoras (CDS) do sorgo. Diagramas de Venn foram construídos para identificar genes diferencialmente expressos comuns às três estratégias computacionais, aumentando a acurácia das análises. Para a anotação, foi usada a ferramenta BLAST2GO. Foram obtidos 225 milhões de reads; dentre os 185 milhões usados no mapeamento, 66% foram mapeados em genes e 51% nas CDS. Aproximadamente 77% dos genes e 87% das CDS mapeados apresentaram atividade transcricional (pelo menos um read mapeado), sob as condições do experimento, em ambos os momentos da interação. Um total de 596 e 2.148 genes diferencialmente expressos foram identificados nas respostas iniciais e tardias à infecção, respectivamente; para 79% deles foi possível atribuir uma função. Pelas intersecções, 41 (resposta inicial) e 206 (resposta tardia) genes foram comuns às três estratégias. Sugere-se que a planta percebe o patógeno no início da interação, porém o fungo é capaz de suprimir a resposta de defesa vegetal. Propõe-se que há uma reprogramação da expressão gênica defesa-orientada, favorecendo o desenvolvimento da planta, mesmo com a doença instalada. A expressão de genes relacionados à resistência, às vias de hormônios e com a formação da parede celular (além de inibidores de proteínas fúngicas) sugerem que a planta se empenha drasticamente para sobreviver após 200 dias de interação. Decifrando os perfis do transcritoma da cana na interação com S. scitamineum, este trabalho deve contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos de resistência ao carvão. / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop, and hosts several pathogens, including the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum, the causal agent of smut. The disease reduces the sugarcane crop yield and the quality of its products, and is recognized by the development of a whip-like structure, where teliospores are produced. The objective of this study was to analyze the transcriptome of sugarcane - S. scitamineum interaction and to identify differentially expressed genes from the host in response to fungal infection. Buds of the tolerant variety \'RB92-5345\' were inoculated with S. scitamineum and maintained in a greenhouse for two sampling interaction moments: 120 h after inoculation, and at the moment of the whip emission, 200 days after inoculation. Twelve libraries were constructed based on RNAseq approach. Three computational strategies were used in the mapping step and differential expression analysis of sugarcane genes: (i) STAR and DESeq, using as reference the sorghum genome; (ii) Bowtie 2 and DESeq, and (iii) CLC Genomics Workbench, using as reference the coding sequences (CDS) from sorghum. Venn diagrams were created to identify differential expressed genes that were common to the three computational strategies, thus increasing the analysis accuracy. For annotation, the BLAST2GO tool was used. We have obtained 225 million reads; out of the 185 million reads used for mapping, 66% were mapped to genes and 51% to CDS. Approximately 77% and 87% of the mapped genes and CDS respectively showed transcriptional activity (at least one read was mapped) under the experimental conditions at both interaction moments. A total of 596 and 2,148 differentially expressed genes were identified at early and late responses to the infection, respectively; it was possible to attribute function to 79% of them. Through intersectioning, 41 (early response) and 206 (late response) genes were found to be common to the three strategies. It is suggested that the plant recognizes the pathogen at the beginning of interaction period, though the fungal is able to suppress the host defense response. It is also proposed that a defense-oriented transcriptional reprogramming takes place, supporting plant development even with the disease setting. The expression of genes related to resistance, hormone pathways, and cell wall formation (as well as inhibitors of fungal proteins) suggests that the plant makes exceptional efforts to survive after 200 days of interaction. Deciphering the sugarcane transcriptome profile during the interaction with S. scitamineum, this study should contribute to a better understanding of the resistance mechanisms to the smut.

O carvão é uma das doenças mais importantes da cana-de-açúcar. Grande parte dos Programas de Melhoramento Genético dessa cultura utiliza inoculações artificiais para selecionar e caracterizar as variedades quanto a sua resistência a doenças. Assim o conhecimento das condições favoráveis para infecção torna-se indispensável. Neste trabalho foram estudadas as condições que afetam a infecção de gemas pelo fungo Sporisorium scitamineum. Do ponto de vista do hospedeiro foi avaliada a incidência de chicotes para diferentes idades das gemas e das brotações das variedades NA56-79, SP71-1406 e SP84-2066. As gemas mais novas mostraram-se mais suscetíveis que as medianas e velhas, porém na variedade mais suscetível, a SP84-2066, não houve diferenças na taxa de infecção das gemas mais novas e velhas. Gemas sem prébrotação e com pré-brotação de 1 dia foram infectadas pelo fungo enquanto que gemas pré-brotadas com 4, 6, 8 e 10 dias não foram infectadas. Para o patógeno, foi avaliada a concentração de teliósporos para a inoculação. As concentrações de 1x106 e 1x 108 foram as únicas que produziram sintomas e sinais, não diferindo a incidência da doença entre elas. Como condições de pós inoculação foram testadas as variáveis temperatura de 25, 28 e 32 °C, umidade de 65, 80 e 95% e períod o de incubação de 24, 48 e 96 horas. Foram realizados dois experimentos em tempos diferentes, sendo que no primeiro foram utilizadas as variedades NA56-79, SP71-1406 e SP84-2066 e no segundo, além das citadas, foram acrescentadas as variedades SP79-2312 e IAC66-6. O tratamento de 28°C, 65% de umidade por um período de 24 horas foi o que promoveu maior índice de infecção, para todas as variedades, exceto a SP84-2066 que foi favorecida por umidade de 95%. Além desses parâmetros foi avaliado o método de inoculação por aspersão de teliósporos e do ferimento seguido por aspersão de teliósporos. A inoculação por ferimento proporcionou maior índice de infecção para as variedades NA56-79, RB72-454, IAC66-6, SP70-1143, mas não teve interferência nas variedades SP79-1011, SP80-185 e SP86-155. Um segundo objetivo do trabalho foi validar um método de diagnose precoce para o carvão. Para isto foram desenvolvidos iniciadores específicos para a detecção de S. scitamineum. Esses iniciadores foram avaliados quanto a sua especificidade e sensibilidade e demonstraram bons resultados. Para a validação prática, plantas de 12 variedades inoculadas tiveram suas folhas amostradas aos 20, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135 e 150 dias após o plantio. Todas as plantas que apresentaram o chicote puderam ser diagnosticadas precocemente com o método criado. As datas de diagnóstico precoce foram de no mínimo 30 dias e no máximo 120 dias antes do aparecimento do sintoma/sinal. Este é um método que pode ser incorporado para os testes de quarentena reduzindo a permanência de plantas na casa de vegetação e reduzindo os custos de manutenção dessas plantas. / Smut is one of the most important diseases of sugarcane. Most part of genetic breeding programs from this culture use artificial inoculation in order to select and characterize the varieties regarding their resistance to diseases. Therefore knowledge of favorable conditions for infection becomes indispensable. This work studied conditions that affect bud infection by the fungus Sporisorium scitamineum. From the standpoint of the host it was assessed the whip incidence for different bud ages and shoot of the varieties NA56-79, SP71-1406 and SP84-2066. The younger buds were more susceptible than median and older ones, but in the susceptible variety, SP84-2066, there were no differences in the younger and older bud infection rates. Buds with and without shoots of 1 day were infected with the fungus while pre-sprouting buds with 4, 6, 8 and 10 days were not infected. For the pathogen it was evaluated teliospore concentration for inoculation. The concentrations 1x106 and 1x 108 were the only ones that produced symptoms and signs, not differing disease incidence among them. As pos-inoculation conditions the variables tested were temperature of 25, 28 and 32 °C, humidity of 65, 80 and 95% and incubation period of 24, 48 and 96 hours. Two experiments were performed at different times, the first one were used NA56-79, SP71- 1406 and SP84-2066 varieties and the second one, besides those mentioned, it was added SP79-2312 and IAC66-6 varieties. The treatment of 28 °C, 65% humidity and for a period of 24 hours was the one that promoted the highest infection rate, for all varieties, except for SP84-2066 that was favored by 95% of humidity. Besides these parameters, it was evaluated the inoculation method by teliospore spraying and wound followed by teliospore spraying. Inoculation by wounding provided higher infection rate for the NA56-79, RB72-454, IAC66-6, SP70-1143 varieties, however it had no interference in SP79-1011, SP80-185 and SP86-155 varieties. A second objective was to validate a method of early diagnosis of smut. Thus, it was developed specific primers to detect S. scitamineum. These primers were evaluated for their specificity and sensibility and showed good results. To practice validation, plants of 12 varieties inoculated had their leaves sampled at 20, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135 and 150 days after planting. All the plants that presented whip could be early diagnosed by the created method. The dates of premature diagnosis were of at least 30 days and a maximum of 120 days before symptom/sign onset. This method can be incorporated for quarantine tests, reducing permanence of plant in greenhouse and reducing maintenance costs of these plants and varieties selection.

O carvão é uma das doenças mais importantes da cana-de-açúcar. Grande parte dos Programas de Melhoramento Genético dessa cultura utiliza inoculações artificiais para selecionar e caracterizar as variedades quanto a sua resistência a doenças. Assim o conhecimento das condições favoráveis para infecção torna-se indispensável. Neste trabalho foram estudadas as condições que afetam a infecção de gemas pelo fungo Sporisorium scitamineum. Do ponto de vista do hospedeiro foi avaliada a incidência de chicotes para diferentes idades das gemas e das brotações das variedades NA56-79, SP71-1406 e SP84-2066. As gemas mais novas mostraram-se mais suscetíveis que as medianas e velhas, porém na variedade mais suscetível, a SP84-2066, não houve diferenças na taxa de infecção das gemas mais novas e velhas. Gemas sem prébrotação e com pré-brotação de 1 dia foram infectadas pelo fungo enquanto que gemas pré-brotadas com 4, 6, 8 e 10 dias não foram infectadas. Para o patógeno, foi avaliada a concentração de teliósporos para a inoculação. As concentrações de 1x106 e 1x 108 foram as únicas que produziram sintomas e sinais, não diferindo a incidência da doença entre elas. Como condições de pós inoculação foram testadas as variáveis temperatura de 25, 28 e 32 °C, umidade de 65, 80 e 95% e períod o de incubação de 24, 48 e 96 horas. Foram realizados dois experimentos em tempos diferentes, sendo que no primeiro foram utilizadas as variedades NA56-79, SP71-1406 e SP84-2066 e no segundo, além das citadas, foram acrescentadas as variedades SP79-2312 e IAC66-6. O tratamento de 28°C, 65% de umidade por um período de 24 horas foi o que promoveu maior índice de infecção, para todas as variedades, exceto a SP84-2066 que foi favorecida por umidade de 95%. Além desses parâmetros foi avaliado o método de inoculação por aspersão de teliósporos e do ferimento seguido por aspersão de teliósporos. A inoculação por ferimento proporcionou maior índice de infecção para as variedades NA56-79, RB72-454, IAC66-6, SP70-1143, mas não teve interferência nas variedades SP79-1011, SP80-185 e SP86-155. Um segundo objetivo do trabalho foi validar um método de diagnose precoce para o carvão. Para isto foram desenvolvidos iniciadores específicos para a detecção de S. scitamineum. Esses iniciadores foram avaliados quanto a sua especificidade e sensibilidade e demonstraram bons resultados. Para a validação prática, plantas de 12 variedades inoculadas tiveram suas folhas amostradas aos 20, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135 e 150 dias após o plantio. Todas as plantas que apresentaram o chicote puderam ser diagnosticadas precocemente com o método criado. As datas de diagnóstico precoce foram de no mínimo 30 dias e no máximo 120 dias antes do aparecimento do sintoma/sinal. Este é um método que pode ser incorporado para os testes de quarentena reduzindo a permanência de plantas na casa de vegetação e reduzindo os custos de manutenção dessas plantas. / Smut is one of the most important diseases of sugarcane. Most part of genetic breeding programs from this culture use artificial inoculation in order to select and characterize the varieties regarding their resistance to diseases. Therefore knowledge of favorable conditions for infection becomes indispensable. This work studied conditions that affect bud infection by the fungus Sporisorium scitamineum. From the standpoint of the host it was assessed the whip incidence for different bud ages and shoot of the varieties NA56-79, SP71-1406 and SP84-2066. The younger buds were more susceptible than median and older ones, but in the susceptible variety, SP84-2066, there were no differences in the younger and older bud infection rates. Buds with and without shoots of 1 day were infected with the fungus while pre-sprouting buds with 4, 6, 8 and 10 days were not infected. For the pathogen it was evaluated teliospore concentration for inoculation. The concentrations 1x106 and 1x 108 were the only ones that produced symptoms and signs, not differing disease incidence among them. As pos-inoculation conditions the variables tested were temperature of 25, 28 and 32 °C, humidity of 65, 80 and 95% and incubation period of 24, 48 and 96 hours. Two experiments were performed at different times, the first one were used NA56-79, SP71- 1406 and SP84-2066 varieties and the second one, besides those mentioned, it was added SP79-2312 and IAC66-6 varieties. The treatment of 28 °C, 65% humidity and for a period of 24 hours was the one that promoted the highest infection rate, for all varieties, except for SP84-2066 that was favored by 95% of humidity. Besides these parameters, it was evaluated the inoculation method by teliospore spraying and wound followed by teliospore spraying. Inoculation by wounding provided higher infection rate for the NA56-79, RB72-454, IAC66-6, SP70-1143 varieties, however it had no interference in SP79-1011, SP80-185 and SP86-155 varieties. A second objective was to validate a method of early diagnosis of smut. Thus, it was developed specific primers to detect S. scitamineum. These primers were evaluated for their specificity and sensibility and showed good results. To practice validation, plants of 12 varieties inoculated had their leaves sampled at 20, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135 and 150 days after planting. All the plants that presented whip could be early diagnosed by the created method. The dates of premature diagnosis were of at least 30 days and a maximum of 120 days before symptom/sign onset. This method can be incorporated for quarantine tests, reducing permanence of plant in greenhouse and reducing maintenance costs of these plants and varieties selection.

A cana-de-açúcar constitui uma das principais fontes de alimento e de energia renovável no mundo. Entre os fatores bióticos que reduzem sua produtividade, destaca-se o carvão, doença causada pelo fungo biotrófico Sporisorium scitamineum, cujos danos à cultura podem ultrapassar 80%. No entanto, poucos estudos foram desenvolvidos sobre a genética desse patógeno. Assim, o presente trabalho estudou a dinâmica de marcas RFLP associados à região subtelomérica (tel-RFLP) e marcas GFP em três populações do patógeno (a, b e c) obtidas em ciclos sucessivos da doença. A população a inicialmente foi formada pela inoculação com teliósporos F1 oriundos do isolado 39 produzido em trabalho anterior (REIS, 2012). As populações b e c foram produzidas inicialmente por cruzamentos controlados. Estes envolveram como parentais esporídios haploides de tipos de reação sexual compatíveis e perfis tel-RFLP conhecidos. Na população b os esporídios parentais (18A e 39B) foram isolados de teliósporos distintos, apresentaram perfis tel-RFLP mais contrastantes e simularam fecundação cruzada. Na população c, os esporídios parentais 39Agfp e 39Bgfp apresentaram perfis tel- RFLP mais semelhantes. Esses mutantes foram obtidos pela inserção heteróloga do gene gfp em esporídios obtidos de um único teliósporo simulando autofecundação (reação sexual intra-tétrade). A comparação entre os perfis de tel-RFLP dos esporídios selvagens e mutantes GFP detectou a inserção do gene gfp possivelmente na região subtelomérica do individuo 39Agfp (parental). A cada ciclo da doença teliósporos selvagens e mutantes GFP foram obtidos, sendo isolados dois esporídios para os cruzamentos controlados que levaram à produção do ciclo seguinte de doença. O uso de cruzamentos controlados possibilitou a produção de teliósporos idênticos geneticamente, permitindo inferir sobre eventos meióticos ocorrentes numa mesma progênie. A fenotipagem sexual dos esporídios que tiveram os perfis de tel-RFLP analisados reduziu o viés advindo do desvio da segregação esperada de 1:1 entre os tipos sexuais de esporídios pertencentes à mesma divisão meiótica. Além disso, auxiliou na detecção de recombinantes, visto que os loci de reação sexual segregam na meiose I. A análise das marcas tel-RFLP das progênies mutantes GFP e selvagens, obtida respectivamente em 1 e 2 ciclos da doença, evidenciou eventos de recombinação na segregação de cromossomos homólogos e eventos de recombinação homóloga. Mesmo apresentando número elevado, as marcas tel-RFLP foram capazes de rastrear indivíduos pertencentes a uma mesma população, o que poderá auxiliar em futuras avaliações epidemiológicas do carvão da cana-de-açúcar. Por fim, a expressão do gene gfp em células de pró-basídios mutantes possibilitou a detecção de recombinação homóloga associada a essa marca e a observação inédita de tétrades lineares de quatro células para essa espécie. Observou-se elevado potencial de utilização do gene gfp em estudos genéticos aplicados a esse patossistema. A recombinação sugerida na região subtelomérica mostrou frequência de recombinação ainda não descrita para essa espécie a ser estudada posteriormente. / Sugarcane is a major source of food and renewable energy in the world. Among the biotic factors that reduce its productivity we highlight the sugarcane smut disease, caused by the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum, whose damages to the crop can overpass 80%. However, few genetic studies have targeted this pathogen. Thus, the present work studied the dynamics of RFLP marks associated to the subtelomeric region (tel-RFLP) and GFP marks of three populations of the pathogen (a, b and c) obtained from consecutive disease cycles. Population a was initially formed with inoculation using teliospores F1 from the whip 39 obtained in previous work (REIS, 2012). Populations b and c were initially produced by controlled crosses of sexual compatible haploid sporidia with known tel-RFLP profiles as parents. In population b the parent sporidia (18A and 39B) were isolated from distinct teliospores, had more different tel-RFLP profiles (7 polymorphic marks) and simulated outcrossing. In population c, the parental sporidia 39Agfp and 39Bgfp had more similar tel-RFLP profiles. These mutants were obtained by heterologous insertion of gfp gene in sporidia obtained from single teliospore, simulating selfing (intra-tetrad mating type). The comparison between wild-type and GFP mutant sporidia tel-RFLP profiles had detected the gfp gene insertion in the subtelomeric region of the individual 39Agfp (parent). For each disease cycle wild-type and GFP mutant teliospores were obtained and two sporidia were isolated to perform controlled crosses that lead to the next disease cycle. The use of controlled crosses resulted in the production of genetically identical teliospores, which allowed inferring about same progeny meiotic occurring events. The sexual phenotyping of the sporidia that had their tel-RFLP analyzed reduced the bias resulted from deviation of expected 1:1 ratio segregation among the mating types of same meiotic division progeny. Besides, it helped in the recombinants detection, due to mating type loci segregation in meiosis I. The analysis of wild-type and GFP mutant progenies tel- RFLP marks, obtained for 2 and 1 disease cycles, has pointed out events of homologous chromosomes recombination and crossing-over events. Despite of the high amount of marks obtained, the tel-RFLP marks allowed the tracking of individuals from the same population, which can benefit future sugarcane smut disease epidemiologic evaluations. Moreover, the gfp gene expression of mutant probasidium cells led to the detection of crossing-over involving the GFP mark and the first observation of linear four-cells tetrads to this species. A high potential use of gfp gene in genetic studies applied to this pathosystem was observed. The recombination suggested for the subtelomeric region showed a recombination frequency haven\'t described for this species that needs to be further studied.

A cana-de-açúcar constitui uma das principais fontes de alimento e de energia renovável no mundo. Entre os fatores bióticos que reduzem sua produtividade, destaca-se o carvão, doença causada pelo fungo biotrófico Sporisorium scitamineum, cujos danos à cultura podem ultrapassar 80%. No entanto, poucos estudos foram desenvolvidos sobre a genética desse patógeno. Assim, o presente trabalho estudou a dinâmica de marcas RFLP associados à região subtelomérica (tel-RFLP) e marcas GFP em três populações do patógeno (a, b e c) obtidas em ciclos sucessivos da doença. A população a inicialmente foi formada pela inoculação com teliósporos F1 oriundos do isolado 39 produzido em trabalho anterior (REIS, 2012). As populações b e c foram produzidas inicialmente por cruzamentos controlados. Estes envolveram como parentais esporídios haploides de tipos de reação sexual compatíveis e perfis tel-RFLP conhecidos. Na população b os esporídios parentais (18A e 39B) foram isolados de teliósporos distintos, apresentaram perfis tel-RFLP mais contrastantes e simularam fecundação cruzada. Na população c, os esporídios parentais 39Agfp e 39Bgfp apresentaram perfis tel- RFLP mais semelhantes. Esses mutantes foram obtidos pela inserção heteróloga do gene gfp em esporídios obtidos de um único teliósporo simulando autofecundação (reação sexual intra-tétrade). A comparação entre os perfis de tel-RFLP dos esporídios selvagens e mutantes GFP detectou a inserção do gene gfp possivelmente na região subtelomérica do individuo 39Agfp (parental). A cada ciclo da doença teliósporos selvagens e mutantes GFP foram obtidos, sendo isolados dois esporídios para os cruzamentos controlados que levaram à produção do ciclo seguinte de doença. O uso de cruzamentos controlados possibilitou a produção de teliósporos idênticos geneticamente, permitindo inferir sobre eventos meióticos ocorrentes numa mesma progênie. A fenotipagem sexual dos esporídios que tiveram os perfis de tel-RFLP analisados reduziu o viés advindo do desvio da segregação esperada de 1:1 entre os tipos sexuais de esporídios pertencentes à mesma divisão meiótica. Além disso, auxiliou na detecção de recombinantes, visto que os loci de reação sexual segregam na meiose I. A análise das marcas tel-RFLP das progênies mutantes GFP e selvagens, obtida respectivamente em 1 e 2 ciclos da doença, evidenciou eventos de recombinação na segregação de cromossomos homólogos e eventos de recombinação homóloga. Mesmo apresentando número elevado, as marcas tel-RFLP foram capazes de rastrear indivíduos pertencentes a uma mesma população, o que poderá auxiliar em futuras avaliações epidemiológicas do carvão da cana-de-açúcar. Por fim, a expressão do gene gfp em células de pró-basídios mutantes possibilitou a detecção de recombinação homóloga associada a essa marca e a observação inédita de tétrades lineares de quatro células para essa espécie. Observou-se elevado potencial de utilização do gene gfp em estudos genéticos aplicados a esse patossistema. A recombinação sugerida na região subtelomérica mostrou frequência de recombinação ainda não descrita para essa espécie a ser estudada posteriormente. / Sugarcane is a major source of food and renewable energy in the world. Among the biotic factors that reduce its productivity we highlight the sugarcane smut disease, caused by the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum, whose damages to the crop can overpass 80%. However, few genetic studies have targeted this pathogen. Thus, the present work studied the dynamics of RFLP marks associated to the subtelomeric region (tel-RFLP) and GFP marks of three populations of the pathogen (a, b and c) obtained from consecutive disease cycles. Population a was initially formed with inoculation using teliospores F1 from the whip 39 obtained in previous work (REIS, 2012). Populations b and c were initially produced by controlled crosses of sexual compatible haploid sporidia with known tel-RFLP profiles as parents. In population b the parent sporidia (18A and 39B) were isolated from distinct teliospores, had more different tel-RFLP profiles (7 polymorphic marks) and simulated outcrossing. In population c, the parental sporidia 39Agfp and 39Bgfp had more similar tel-RFLP profiles. These mutants were obtained by heterologous insertion of gfp gene in sporidia obtained from single teliospore, simulating selfing (intra-tetrad mating type). The comparison between wild-type and GFP mutant sporidia tel-RFLP profiles had detected the gfp gene insertion in the subtelomeric region of the individual 39Agfp (parent). For each disease cycle wild-type and GFP mutant teliospores were obtained and two sporidia were isolated to perform controlled crosses that lead to the next disease cycle. The use of controlled crosses resulted in the production of genetically identical teliospores, which allowed inferring about same progeny meiotic occurring events. The sexual phenotyping of the sporidia that had their tel-RFLP analyzed reduced the bias resulted from deviation of expected 1:1 ratio segregation among the mating types of same meiotic division progeny. Besides, it helped in the recombinants detection, due to mating type loci segregation in meiosis I. The analysis of wild-type and GFP mutant progenies tel- RFLP marks, obtained for 2 and 1 disease cycles, has pointed out events of homologous chromosomes recombination and crossing-over events. Despite of the high amount of marks obtained, the tel-RFLP marks allowed the tracking of individuals from the same population, which can benefit future sugarcane smut disease epidemiologic evaluations. Moreover, the gfp gene expression of mutant probasidium cells led to the detection of crossing-over involving the GFP mark and the first observation of linear four-cells tetrads to this species. A high potential use of gfp gene in genetic studies applied to this pathosystem was observed. The recombination suggested for the subtelomeric region showed a recombination frequency haven\'t described for this species that needs to be further studied.