Mutationen von Transkriptionsfaktoren (TF) betreffen nicht nur die Funktion des TFs, sondern auch die Expression seiner Zielgene und liegen häufig angeborenen Entwicklungsdefekten zugrunde. Über 20 Mutationen in HOXD13, einem TF der die Entwicklung der Extremitäten kontrolliert, sind bisher als Ursache verschiedenartiger Extremitätenfehlbildungen entdeckt worden. Eine molekularbiologische Grundlage für die Vielgestaltigkeit der HOXD13-Mutationen ist jedoch unbekannt. Die bisherigen Methoden zur funktionellen Charakterisierung von TF-Mutationen ermöglichten eine lediglich eingeschränkte Interpretation der molekularen Pathomechanismen. Die kürzlich entwickelte ChIP-seq Methode ermöglicht eine umfassende, funktionelle Charakterisierung eines TFs. In dieser Arbeit wurde eine Methode etabliert, um eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren und TF-Mutationen systematisch zu untersuchen. Zur Validierung wurden zwei neue Punktmutationen in HOXD13, p.Q317K und p.R298Q, charakterisiert. Beide Mutationen betreffen die DNA-bindende Domäne von HOXD13, rufen aber stark unterschiedliche Fehlbildungen hervor. Die Ergebnisse zeigen, dass die HOXD13Q317K Mutante eine veränderte Sequenzspezifität aufweist, welche nun jener eines anderen TFs, PITX1, ähnelt. Auch genomweit zeigt HOXD13Q317K ein Bindungsprofil, welches eher PITX1 als HOXD13wt entspricht. Durch weitere, unabhängige Analysen und Experimente wurde bestätigt, dass die p.Q317K Mutation HOXD13 in einen TF mit PITX1-ähnlichen Eigenschaften verändert. Die HOXD13R298Q-Mutante zeigt eine weitgehend unveränderte Bindungssequenz gegenüber HOXD13wt, jedoch eine veränderte Zusammensetzung der genomischen Bindestellen. Dies weist, in Kombination mit dem humanen Phänotyp auf einen dominant-negativen Pathomechanismus dieser Mutanten hin. Zusammengenommen zeigt diese Arbeit durch die Erhebung von experimentellen Daten, dass klar unterscheidbare molekularbiologische Mechanismen den HOXD13Q317K- und HOXD13R298Q-Mutationen zugrunde liegen. / Mutations in transcription factors (TF) do not only affect the function of the TF, but also the expression of its target genes and are frequently underlying congenital malformations. More than 20 distinct pathogenic mutations in HOXD13, a TF controlling limb development, have been associated with a broad range of limb malformations. However, a molecular basis underlying the variability of HOXD13-associated phenotypes remains elusive. To date, the experimental methods used to functionally characters TF mutations have allowed only limited insights into the underlying molecular pathomechanisms. The recently developed ChIP-seq technology has proven to be a powerful method to profile the binding characteristics of TFs; however a number of technical hurdles hinder its application for functional characterization of mutant TFs. This work describes the establishment of a ChIP-seq approach to investigate a wide spectrum of TFs and TF mutations. The approach was applied to characterize two previously unknown missense mutations in HOXD13, p.Q317K and p.R298Q, which both alter the DNA-binding domain of HOXD13 but cause very different disease phenotypes. The results show that the HOXD13Q317K mutant has an altered sequence specificity that resembles the recognition sequence of another TF, PITX1. Further, the genome-wide binding pattern of HOXD13Q317K shifts towards a more PITX1-like binding pattern. Even further analysis and viral overexpression in chicken limb buds confirm that the mutation partially converts HOXD13Q317K into a TF with PITX1-like properties. The HOXD13R298Q has a largely unchanged sequence specificity, but an altered composition of genomic binding sites. This, in combination with the human phenotype, indicates that the mutant might act in a dominant-negative manner. Collectively, this work shows through generation of direct experimental evidence, that clearly distinct molecular mechanisms underlie the pathogenicity of HOXD13Q317K and HOXD13R298Q mutations.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/17754 |
| Date | 08 January 2015 |
| Creators | Ibrahim, Daniel Murad |
| Contributors | Mundlos, Stefan, Seemann, Petra |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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