Introdução: As proteínas alimentares são fontes de peptídeos atuantes em vários processos metabólicos. Existem evidências de que a proteína do feijão caupi (Vigna unguiculata L. Walp) é capaz de reduzir o colesterol em hamsters e em humanos, porém, a permeabilidade após a digestão, o mecanismo de ação e a evidência direta da participação de peptídeos no metabolismo colesterol não são claros. Objetivo: Investigar a permeabilidade intestinal e avaliar o efeito nas vias luminal e endógena do metabolismo do colesterol de peptídeos provenientes de feijão caupi (Vigna unguiculata L. Walp). Metodologia: A permeabilidade dos peptídeos provenientes do caupi produzidos por hidrólise enzimática foi testada em linhagens de células Caco-2 usando placas Transwell®. Para investigar o efeito na via luminal, três peptídeos identificados na fração 3 kDa do hidrolisado (LLNPDDEQL; FFFGQDGGSKGEE e LNL) foram testados na solubilização de colesterol e fosfatidilcolina, no tamanho das micelas de colesterol e interação com ácidos biliares in vitro. Para verificar o efeito no metabolismo endógeno, linhagens de células HepG2 foram incubadas com peptídeos sintéticos (MELNAVSVVHS e MELNAVSVVSH) identificados como resultado do ensaio de permeação nas células Caco-2. A expressão de RNAm dos transportadores de colesterol NPC1L1, ABCA1 e ABCG1 foi realizada nas células Caco-2 e a expressão de HMGCR, SREBP2, LDLR, LXR, AMPK1 foi avaliada nas células HepG2. Resultados: A exposição das células Caco-2 à fração 3 kDa do hidrolisado (2,5 e 5 mg/mL) aumentou a expressão de ABCG1 nos tempos 6 h e 12 h. O níveis de RNAm dos genes SREBP2, HMGCR e LDLR reduziram nas HepG2 após 24h do tratamento com o peptídeo MELNAVSVVHS (50 M e 100 M). A fração 3 kDa do hidrolisado e os peptídeos LLNPDDEQL; FFFGQDGGSKGEE e LNL foram capazes de reduzir a solubilidade do colesterol micelar in vitro em no máximo 42 por cento , bem como, provocaram mudanças estruturais ao interagirem com a fosfatidilcolina, com destaque ao peptídeo LNL (50 por cento de ligação). O peptídeo LNL foi o único capaz de promover a precipitação do colesterol em forma de cristais devido à interação com os ácidos biliares. Conclusões: A fração 3 kDa do hidrolisado e todos os peptídeos testados foram capazes de insolubilizar o colesterol in vitro. Constata-se que o mecanismo de competição pelo espaço intramicelar com o colesterol se dá pela interação com os componentes micelares e não diretamente com o colesterol. O peptídeo do feijão caupi MELNAVSVVHS foi permeável e foi capaz de reduzir a expressão do fator de transcrição SREBP2 (consequentemente reduzindo HMGCR e LDLR) / Introduction: Food proteins are sources of peptides acting in sevral metabolic processes. There is evidence that cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) protein is able to lower cholesterol levels in hamsters and humans, but its permeability after digestion, mechanism of action and direct evidences of peptide participation in cholesterol metabolism are not clear. Objective: To investigate the intestinal permeability and to evaluate the effect on the luminal and endogenous cholesterol metabolism pathways of peptides from cowpea (Vigna unguiculata L. Walp). Methods: The permeability of the cowpea peptides produced by enzymatic hydrolysis was tested on Caco-2 cell lines using Transwell® plates. To investigate the effect on the luminal pathway, three peptides identified in the 3 kDa hydrolyzate fraction (LLNPDDEQL; FFFGQDGGSKGEE and LNL) were tested for in vitro cholesterol and phosphatidylcholine solubilization, cholesterol micelle size changing and interaction with bile acids. To verify the effect on endogenous metabolism, HepG2 cell lines were incubated with synthetic peptides (MELNAVSVVHS or MELNAVSVVSH) identified as a result of the permeation assay on Caco-2 cells. The mRNA expression of the cholesterol transporters NPC1L1, ABCA1 and ABCG1 was performed on Caco-2 cells and the expression of HMGCR, SREBP2, LDLR, LXR, AMPK1 was evaluated in HepG2 cells. Results: Exposure of Caco-2 cells to the 3 kDa hydrolyzate fraction (2.5 and 5 mg/mL) increased ABCG1 expression at 6 h and 12 h times. The mRNA levels of the SREBP2, HMGCR and LDLR genes were reduced in HepG2 after 24h of treatment with the MELNAVSVVHS peptide (50 M and 100 M). The 3 kDa of the hydrolyzate fraction and the peptides LLNPDDEQL; FFFGQDGGSKGEE and LNL were able to reduce the solubility of micellar cholesterol in vitro in a maximum of 42 per cent , as well as, caused structural changes when interacting with phosphatidylcholine, with emphasis on the LNL peptide (50 per cent of binding). The LNL peptide alone was able to promote cholesterol precipitation in the form of crystals due to interaction with bile acids. Conclusions: The 3 kDa hydrolysate fraction and all peptides tested were able to insolubilize cholesterol in vitro. It was observed that the mechanism of competition for the intramicellar space with cholesterol is given by the interaction with the micellar components and not directly with the cholesterol. The MELNAVSVVHS cowpea peptide was permeable and was able to reduce the expression of the SREBP2 transcription factor (thereby reducing HMGCR and LDLR)
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29052017-170242 |
| Date | 09 March 2017 |
| Creators | Marques, Marcelo Rodrigues |
| Contributors | Areas, Jose Alfredo Gomes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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