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Previous issue date: 2013-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The application of preparative high pressure liquid chromatography (PREP-HPLC) in the isolation of natural products is shown as a robust, versatile and fast technique that ensures the purification and isolation of substances in complex matrices, as natural products. This technique is a powerful tool in an area in which purification and obtainment of samples in large amount is somewhat laborious, and often, there is a need for re-isolation of samples; thus, its reproducibility is a great advantage. The combination of HPLC with mass spectrometry allows merging the advantages of chromatography, such as the high selectivity and separation efficiency, with the mass spectrometry advantages, as information related to molecular structure, the molar mass and enhancement of additional selectivity. Cissampelos sympodialis Eichl. is a Brazilian species and the infusion of this plant is traditionally used in the northeast of Brazil to treat asthma, bronchitis and rheumatism, between other inflammatory diseases. The objective of this work to develop a rapid and reproducible method for isolation of established chemical biomarkers of plant and other alkaloids from C. sympodialis Eichl., and use the standard of warifteine in quantification of it in biological fluids to determine the pharmacokinetic parameters of the alkaloid after administration of it in rats in vivo. The chromatographic method consisted of a gradient from 0-15 min (75 % B), 15-20 min (80 % B), 20-25 min (100 % B), 278 nm, and flow of 5.0 mL/min during 20 min, with mobile phase of methanol (B) and water (A) basified with ammonium to reach pH 8.0, and the amount of sample mass injected per experiment was 800 mg. The alkaloids isolated were warifteine (99.79 % of purity), methyl-warifteine (98.52 % of purity), the mixture of epimers of desmethyl-roraimine, and a new alkaloid not referred in literature that was elucidated and named as Sousine. Animals from Ratus novergicus species received an intravenous single dose of warifteine of 1.0 mg/Kg, and the blood samples were collected in 5, 15, 30, 60, 120 and 180 minutes. The blood samples were centrifuged to obtain the plasma and then were extracted by protein precipitation with acetonitrile. The pharmacokinetic parameters were calculated based on plasmatic concentrations versus time curves using non-compartmental model. The linearity range to chromatographic method was between 10 and 500 ng/mL e the kinetic parameters were Cmáx 16.08 μg/mL, Tmáx 12.5 min-1, Kel 0.01355 min-1. The method developed to isolation of alkaloids from C. sympodialis Eichl. is a practical, rapid and robust one. The HPLC-MS/MS method enabled to quantify warifteine in rat plasma with samples extraction by protein precipitation, yet, there was a great variability between animals in the kinetics experiment. / A aplicação da cromatografia a líquido de alta eficiência preparativa (CLAE-PREP) no isolamento de produtos naturais, mostra-se como uma técnica robusta, versátil e rápida, que garante a purificação e o isolamento de substâncias de matrizes complexas, como os produtos naturais. Essa técnica é uma ferramenta valiosa numa área em que a purificação e obtenção de amostras em quantidade é algo laborioso, e muitas vezes, há necessidade de reisolamento de amostras; assim, sua reprodutibilidade é uma grande vantagem. A combinação da CLAE com a espectrometria de massas permite unir as vantagens da cromatografia, como a alta seletividade e eficiência de separação, às vantagens da espectrometria de massas, como a obtenção de informação estrutural, massa molar e aumento adicional de seletividade. Cissampelos sympodialis Eichl. é uma espécie da flora brasileira, a infusão das raízes da planta é popularmente utilizada no nordeste do Brasil para tratamento de asma, bronquite e reumatismo, dentre outras enfermidades inflamatórias. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método rápido e reprodutível para o isolamento dos marcadores químicos estabelecidos e de outros alcaloides de C. sympodialis Eichl., e utilizar o padrão de warifteína para quantificação da mesma em fluidos biológicos com vistas à determinação de parâmetros farmacocinéticos do alcaloide após administração in vivo em ratos. O método cromatográfico utilizado consistiu em gradiente de 0-15 min (75 %), 15-20 min (80 %), 20-25 min (100 %), de 278 nm, fluxo de 5,0 mL/min e tempo de corrida de 20 min, com fase móvel de metanol e água, ambos basificados com amônia para pH 8,0 e a massa de FATT-rz injetada por cada corrida cromatográfica na coluna foi 800 mg. Foram isolados os alcaloides warifteína (pureza 99,79%), metil-warifteína (pureza 98,52%), os epímeros de desmetil-roraimina, além de um alcaloide inédito na literatura que teve sua estrutura elucidada e foi denominado de Sousina. Animais da espécie Ratus wistar receberam dose única de 1,0 mg/Kg de warifteína intravenosa e as coletas de sangue foram realizadas nos tempos 5, 15, 30, 60, 120 e 180 min. As amostras sangue foram centrifugadas para obtenção do plasma e extraídas por precipitação de proteínas utilizando acetonitrila. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados com base nas curvas de concentração plasmática versus tempo pelo modelo não-compartimental. A faixa de linearidade para o método cromatográfico foi entre 10 e 500 ng/mL e os parâmetros cinéticos foram Cmáx 16,08 μg/mL, Tmáx 12,5 min-1, Kel 0,01355 min-1. O método de isolamento por CLAE-PREP é uma alternativa prática, rápida e robusta para obtenção dos alcaloides de C. sympodialis. O método proposto por CLAE-EM/EM permitiu quantificar a warifteína em fluido plasmático de rato com a extração das amostras por precipitação de proteínas, ainda, houve grande variabilidade interindividual entre os animais usados no experimento cinético.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.biblioteca.ufpb.br:tede/6839 |
| Date | 29 August 2013 |
| Creators | Melo, Antonilêni Freire Duarte Medeiros |
| Contributors | Oliveira, Eduardo de Jesus |
| Publisher | Universidade Federal da Paraíba, Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, UFPB, BR, Farmacologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFPB, instname:Universidade Federal da Paraíba, instacron:UFPB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -3526991091727869, 600, 600, 600, 600, 1949513326075358303, 700814650651154363, 2075167498588264571 |
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