Este trabalho descreve a produção dos FGFs básico bovino e ácido humano (há) em E. coli utilizando o vetor pET. Para expressar o haFGF utilizamos o cDNA nativo com pequenas modificações, obtendo cerca de 40 mg da proteína por litro de cultura induzida. No caso do bbFGF, cerca de 60 pares de bases da extremidade 5 do cDNA nativo foram substituídos por oligonucleotídeos sintéticos contendo condons frequentemente usados em genes bacterianos altamente expressos e apresentando menor conteúdo de C+G do que a sequência nativa. Com este cDNA modificado, obteve-se cerca de 10mg 1-1 de bbFGF. Os FGFs intracelulares solúveis foram purificados a partir do extrato bacteriano por chromatografia de afinidade em Heparina-Sepharose atingindo um grau de pureza da ordem de 95%. O haFGF sozinho é ativo sobre fibroblastos 3T3 em cultura na concentração de ng ml-1; na presença de heparina, a atividade desloca-se para a faixa de pg ml-1. O bbFGF é ativo na concentração de pg ml-1 e sua atividade não é significantemente potenciada pela heparina. O sequenciamento da extremidade N-terminal e a análise de aminoácidos mostraram somente uma forma de haFGF recombinante correspondente à proteína autêntica de 154 aminoácidos. Foram encontradas duas formas de bbFGF recombinante, uma correspondente à proteína autêntica de 154 resíduos e outra contendo 153, onde os dois primeiros foram removidos. / Here we describe the use of the pET expression system to produce the 154 amino acid bovine basic (bb) and human acidic (ha) FGFs. To express haFGF we have used the native cDNA sequencewith minor modifications, obtaining about 40 mg of growth factor per liter of bacterial culture. In the case of bbFGF, about 60 base pairs form the 5-end of the native cDND were replaced with synthetic oligonucleotides containing codons frequently used in highly expressed bacterial genes and having a lower G+C content than the native sequence. By using this modified cDNA about 10 mg 1-1 of bbFGF was obtained. The intracellular, soluble FGFs were partially purified from bacterial extracts by heparin-affinity chromatography and shown to be more than 95% pure. The haFGF alone is active upon 3T3 fibroblasts in culture at the level of ng ml-1 or in the range of pg ml-1 when heparin is added to the incubation medium. The bbFGF is active in the range of pg ml-1 and its activity is not significantly potentiated by heparin. Only one form of recombinant haFGF corresponding to the authentic protein of 154 amino acids was found by N-terminal protein sequencing and amino acid analysis. Two forms of recombinant bbFGF were found, one corresponding to the authentic protein of 154 amino acids (about 75%) and another containing 153 amino acids where the first two residues were removed (about 25%>).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-25112014-172008 |
| Date | 12 March 1992 |
| Creators | Miyamoto, Catarina Akiko |
| Contributors | Gambarini, Angelo Geraldo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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