O desenvolvimento dos órgãos vegetativos e florais das angiospermas depende da ação combinada e finamente regulada de eventos de proliferação e expansão celular. Estudar os genes envolvidos com a regulação destes processos permite ampliar nossa compreensão sobre o desenvolvimento da flor, de seus diferentes órgãos, do processo reprodutivo como um todo, além de permitir produzir modificações de interesse econômico. Um gene codificando uma proteína da família F-box foi identificado na biblioteca TOBEST de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). A maioria das proteínas F-box pertence ao complexo SCF (formado principalmente pelas proteínas SKP1, CUL1 e F-box), participando da marcação de proteínas alvo para a degradação pela via ubiquitina-proteassomo. O gene identificado no TOBEST demonstrou expressão preferencial nos órgãos florais e foi denominado FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Plantas de silenciamento e superexpressão deste gene indicaram alterações no tamanho dos órgãos florais, incluindo o pistilo, foco principal de estudo em nosso laboratório (Abbad, 2012). O screening de duplo-híbrido de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum identificou a interação com uma SKP1, indicando que a FEF1 poderia atuar junto ao complexo SCF (Abbad, 2012). No presente trabalho foram realizadas análises macroscópicas e microscópicas em pistilos de plantas transgênicas da geração T1, que permitiram: 1) verificar a estabilidade dos transgenes e das alterações fenotípicas na descendência; 2) quantificar e analisar estatisticamente as alterações de tamanho do pistilo; e 3) verificar as alterações em nível celular, que resultaram nas alterações do tamanho do pistilo, ocorridas nas plantas transgênicas. As plantas de silenciamento apresentaram redução estatisticamente significativa do comprimento de pistilos e da largura dos ovários. As análises histológicas permitiram verificar que ocorreu a redução da proliferação celular na zona secretória do estigma e no parênquima do ovário destas plantas. Por outro lado, as plantas de superexpressão demonstraram aumento estatisticamente significativo do comprimento dos pistilos e da largura de estigmas e ovários. Nestas plantas, foi verificado o aumento do número de células na zona secretória do estigma e parênquima do ovário. A interação entre FEF1 e a SKP1 foi confirmada em experimento de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), corroborando a participação dessa F-box no complexo SCF. A interação entre estas proteínas ocorre no citoplasma das células vegetais, indicando que este é o local de atuação de FEF1. A participação no complexo SCF confere a essa F-box o papel de seleção dos alvos a serem poliubiquitinados pelo complexo. A análise de candidatos do screening revelou três novos parceiros de interação de FEF1, todos fatores de transcrição da classe I da família TCP, relacionados com a regulação da proliferação celular. Estas proteínas são candidatas à degradação no proteassomo, sinalizada pela marcação promovida pelo complexo SCFFEF1. Deste modo, propomos que a FEF1 desempenhe uma função na regulação do desenvolvimento e do tamanho final dos órgãos florais, mais especificamente do pistilo, através da regulação dos níveis de fatores de transcrição, como as TCPs aqui encontradas, envolvidas com o controle da proliferação celular. / Angiosperms vegetative and flowering organs development depends on a combined influence of finely regulated events of cell proliferation and expansion. The study of genes involved with the regulation of this processes allows the expansion of our knowledge about the flower and its organs development, of the reproductive process and allows the production of modifications of economic interest. One gene coding for an F-box family protein was identified in the TOBEST stigma/style cDNA library of N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). The majority of F-box proteins belong to the SCF (mainly composed of the SKP1, CUL1 and F-box proteins) complex, participating in the signalization of target proteins for degradation through the ubiquitin-proteasome pathway. The gene identified on TOBEST presented preferential expression on the floral organs and was named FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Transgenic plants silencing and overexpressing this gene indicated alteration of the floral organs, including the pistil, the main focus of study in our laboratory (Abbad, 2012). A yeast two-hybrid screening of a N. tabacum stigma/style cDNA library revealed the interaction with a SKP1 protein, indicating that FEF1 possibly functions with the SCF complex (Abbad, 2012). In the present work macroscopic and microscopic analysis of the pistils of T1 generation of transgenic plants were performed, which allowed us to: 1) Confirm the transgene and phenotypic stability through generations; 2) Quantify and statistically analyze the size alterations on the pistils; 3) Analyze the cellular modifications that produced the pistils size alterations observed in the transgenic plants. The plants silencing FEF1 presented a statistically significant reduction of the pistil length and ovary width. Histological analysis allowed the observation that a reduction in cell proliferation occurred in the secretory zone of the stigma and in the ovary parenchyma. On the other hand, overexpression plants presented statistically significant enlargement of pistil length and of stigma and ovary width. In these plants it was observed an increase in cell number in the stigma secretory zone and ovary parenchyma. The interaction between FEF1 and SKP1 was confirmed on a BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), reinforcing the participation of this F-box protein in the SCF complex. The interaction between these proteins was observed to occur in the cytoplasm of plant cells, indicating that this is the cellular compartment of FEF1 action. The participation in the SCF complex confers this F-box the role of selecting targets for polyubiquitination by the complex. The analysis of candidates of the screening revealed three new interaction partners of FEF1, all of them transcription factors of the class I TCP family, related to the regulation of cell proliferation. These proteins are candidates for degradation by the proteasome, signalized by the polyubiquitination promoted by the SCFFEF1 complex. We propose that FEF1 has a role in the regulation of the development and final size of the floral organs, particularly the pistil, by regulation the levels of transcription factors like the TCPs here revealed, involved with the control of cell proliferation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22052015-160501 |
| Date | 30 April 2015 |
| Creators | Roberto, Luis Fernando |
| Contributors | Goldman, Maria Helena de Souza |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.003 seconds