Les éléments chimiques métalliques tels que Fe, Cu ou Zn sont présents en quantité infime dans le cerveau. Le rôle de ces métaux traces dans les fonctions neuronales, telles que la transmission synaptique et les processus de mémorisation, reste encore largement à élucider. En outre, une dyshoméostasie des métaux est retrouvée dans de nombreuses neuropathologies, telles que maladie d’Alzheimer, de Parkinson ou sclérose latérale amyotrophique. Les mécanismes d’interaction des métaux traces au niveau neuronal sont difficiles à décrire faute de méthodes analytiques possédant une résolution et une sensibilité adaptées pour en déterminer la distribution à l’échelle synaptique. La spectrométrie de fluorescence-X synchrotron (SXRF) est une méthode d’analyse chimique multi-élémentaire permettant de décrire la distribution quantitative de ces éléments à l’échelle subcellulaire avec une résolution nanométrique (40 nm avec la ligne ID16A du synchrotron ESRF) et une très haute sensibilité. Afin d’interpréter avec précision les résultats d’imagerie chimique, nous avons développé un protocole pour corréler l’imagerie nano-SXRF avec la microscopie super résolutive de déplétion par émission stimulée (STED) permettant ainsi la corrélation des distributions des métaux avec celle de protéines cibles en super résolution. Nous avons marqué les microtubules et l’actine-F de neurones primaires d’hippocampe de rat puis imagé le cytosquelette par microscopie STED avant de déterminer par spectrométrie SXRF les distributions des éléments P, S, Fe, Cu et Zn. Nous avons ainsi mis en évidence la colocalisation du Zn et des microtubules au niveau dendritique ainsi qu’une localisation du Cu essentiellement dans le cou des épines dendritiques riches en F-actine, et une distribution du Fe sous forme de points très localisés dans les dendrites. Ces résultats ont révélé le rôle essentiel du Zn dans l’architecture du cytosquelette des neurones d’hippocampe et la méthode d’imagerie corrélative développée ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude des dyshoméostasies des métaux dans les maladies neurodégénératives. / Metallic chemical elements such as Fe, Cu or Zn are present in minute quantities in the brain. The role of these trace metals in neuronal functions such as synaptic transmission and memory processes remains largely unclear. Moreover, metal dyshomeostasis is found in many neuropathologies, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s or amyotrophic lateral sclerosis. The interaction mechanisms of trace metals at the neuronal level are difficult to describe because of the lack of analytical methods with appropriate resolution and sensitivity to determine metal distribution at the synaptic level. Synchrotron X-ray fluorescence spectrometry (SXRF) is a multielemental chemical analysis method for describing the quantitative distribution of these elements at the sub-cellular scale with a nanometric resolution (40 nm at ESRF beamline ID16A ) and a very high sensitivity. In order to accurately interpret chemical imaging results, we have developed a protocol to correlate nano-SXRF imaging with stimulated emission depletion super resolution microscopy (STED), allowing the correlation of metal distribution and that of target proteins in super resolution. We labeled microtubules and F-actin of primary rat hippocampal neurons and imaged the cytoskeleton by STED microscopy before determining the distributions of P, S, Fe, Cu and Zn by SXRF spectrometry. We evidenced the colocalization of Zn and microtubules at the dendritic level and a localization of Cu mainly in the neck of dendritic spines rich in F-actin, and a distribution of Fe in the form of very localized points in the dendrites. These results highlight the crucial role of Zn in cytoskeleton architecture of hippocampal neurons and the developed correlative imaging method opens new perspectives for the study of metal dyshomeostasis in neurodegenerative diseases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2019BORD0185 |
| Date | 15 October 2019 |
| Creators | Domart, Florelle |
| Contributors | Bordeaux, Ortega, Richard, Choquet, Daniel |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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