Le microscope à force atomique (AFM) est un outil puissant pour l'étude des systèmes biologiques. Dans cette thèse, je me suis intéressé à la corrélation de quatre types de microscopies : la microscopie à force atomique, la microscopie optique à fluorescence à haute résolution, la microscopie électronique, et la microscopie à sonde de Kelvin (KFM). La corrélation des trois premières microscopies a donné naissance à l'approche CLAFEM (Correlative Light Atomic Force Electron Microscopies). Cette technique m'a permis de détecter des organites intracellulaires, tels que l'appareil de Golgi et des mitochondries. Des comètes d'actine dues à l'infection d'une cellule par Shigella flexneri, et le site d'entrée de Yersinia pseudotuberculosis ont été imagés avec cette approche. Parallèlement à cette partie expérimentale, j'ai développé un logiciel, appelé pyAF, pour analyser des courbes de forces et pour corréler les différents types de microscopies. Dans une deuxième partie, j'ai effectué des mesures des propriétés électriques par KFM et exploré la possibilité d'utiliser celle-ci en milieu liquide. L'étude des propriétés électriques en KFM a été effectuée sur des virus de la mosaïque du tabac à l'air, en utilisant des leviers conventionnels. L'utilisation de sondes Kolibri (résonateurs à quartz oscillant à 1 MHz) à l'air et en liquide a été explorée. / The atomic force microscope (AFM) is a powerful tool for the study of biological systems. In this work, I was interested in the correlation of four types of microscopies: the atomic force microscopy, the high resolution fluorescence microscopy, the electron microscopy and the kelvin force microscopy (KFM). The correlation of the three first types of microscopies gave birth to the CLAFEM approach (Correlative Light Atomic Force Electron Microscopies). This technique allowed me to detect intracellular organelles, like the Golgi apparatus and mitochondria. Actin tails due to the infection of cells by the Shigella flexneri bacterium, and the entry site of Yersinia pseudotuberculosis bacteria were imaged with this approach. In parallel to this experimental part, I developed a software, called pyAF, for the analysis of force curves and the correlation of the different types of microscopies. In a second part, I measured electrical properties by KFM and explored the possibility to use KFM in liquid. Electrical properties of tobacco mosaic viruses were studied in air, using conventional cantilevers. I also used a new type of probe, called Kolibri, which is a quartz resonator oscillating at 1 MHz, in air and in liquid.

La métastase peut être considérée comme le produit final d’un processus à la fois biologique mécanique et chimique où les cellules cancéreuses disséminent dans l’organisme pour envahir un nouvel organe à distance en s’établissant dans un nouvel microenvironnement tissulaire. Bien que les métastases soient la principale cause de décès liée au cancer, les principaux mécanismes impliqués dans ce processus restent à élucider. La communauté scientifique manque de techniques d’imagerie adaptées pour disséquer avec la plus haute résolution possible le comportement des cellules tumorales in vivo. Par conséquent, le but principal de ma thèse a été de développer une approche d’imagerie intravitale non-invasive appliquée à la souris. Cette approche a été inclue dans le développement d’un protocole de microscopie corrélative intravitale permettant l’étude de cellules tumorales à différentes échelles dans leur environnement naturel. Ce protocole a été utilisé dans l’étude de cellules invasives tumorales uniques dans l’oreille et le cerveau de la souris. Le but était de décrire les détails des protrusions cellulaires ainsi que les interactions cellule-matrice lors de l’invasion et l’intravasation de cellules cancéreuses. / Metastasis can be considered as the end product of a multistep bio-mechano-chemical process where cancer cells disseminate to anatomically distant organs and home and establish themselves in a new tissue microenvironment. Although metastasis is the leading cause of cancer-related death, the main cellular mechanisms enabling this process remain to be elucidated. Importantly, the scientific community lacks adapted imaging technologies to accurately dissect, at the highest resolution possible, tumor cell behavior in vivo. Therefore, the main goal of my PhD thesis was to develop an intravital and non-invasive imaging approach to track tumor progression in the living mouse. This approach was included in the development of an intravital Correlative Light and Electron Microscopy protocol allowing to track tumor cells at different scales in their natural environment. It was used to study single invasive tumor cells in the mouse ear and brain and to describe the details of cell protrusions and cell-matrix interactions during invasion and intravasation of cancer cells.

Les éléments chimiques métalliques tels que Fe, Cu ou Zn sont présents en quantité infime dans le cerveau. Le rôle de ces métaux traces dans les fonctions neuronales, telles que la transmission synaptique et les processus de mémorisation, reste encore largement à élucider. En outre, une dyshoméostasie des métaux est retrouvée dans de nombreuses neuropathologies, telles que maladie d’Alzheimer, de Parkinson ou sclérose latérale amyotrophique. Les mécanismes d’interaction des métaux traces au niveau neuronal sont difficiles à décrire faute de méthodes analytiques possédant une résolution et une sensibilité adaptées pour en déterminer la distribution à l’échelle synaptique. La spectrométrie de fluorescence-X synchrotron (SXRF) est une méthode d’analyse chimique multi-élémentaire permettant de décrire la distribution quantitative de ces éléments à l’échelle subcellulaire avec une résolution nanométrique (40 nm avec la ligne ID16A du synchrotron ESRF) et une très haute sensibilité. Afin d’interpréter avec précision les résultats d’imagerie chimique, nous avons développé un protocole pour corréler l’imagerie nano-SXRF avec la microscopie super résolutive de déplétion par émission stimulée (STED) permettant ainsi la corrélation des distributions des métaux avec celle de protéines cibles en super résolution. Nous avons marqué les microtubules et l’actine-F de neurones primaires d’hippocampe de rat puis imagé le cytosquelette par microscopie STED avant de déterminer par spectrométrie SXRF les distributions des éléments P, S, Fe, Cu et Zn. Nous avons ainsi mis en évidence la colocalisation du Zn et des microtubules au niveau dendritique ainsi qu’une localisation du Cu essentiellement dans le cou des épines dendritiques riches en F-actine, et une distribution du Fe sous forme de points très localisés dans les dendrites. Ces résultats ont révélé le rôle essentiel du Zn dans l’architecture du cytosquelette des neurones d’hippocampe et la méthode d’imagerie corrélative développée ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude des dyshoméostasies des métaux dans les maladies neurodégénératives. / Metallic chemical elements such as Fe, Cu or Zn are present in minute quantities in the brain. The role of these trace metals in neuronal functions such as synaptic transmission and memory processes remains largely unclear. Moreover, metal dyshomeostasis is found in many neuropathologies, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s or amyotrophic lateral sclerosis. The interaction mechanisms of trace metals at the neuronal level are difficult to describe because of the lack of analytical methods with appropriate resolution and sensitivity to determine metal distribution at the synaptic level. Synchrotron X-ray fluorescence spectrometry (SXRF) is a multielemental chemical analysis method for describing the quantitative distribution of these elements at the sub-cellular scale with a nanometric resolution (40 nm at ESRF beamline ID16A ) and a very high sensitivity. In order to accurately interpret chemical imaging results, we have developed a protocol to correlate nano-SXRF imaging with stimulated emission depletion super resolution microscopy (STED), allowing the correlation of metal distribution and that of target proteins in super resolution. We labeled microtubules and F-actin of primary rat hippocampal neurons and imaged the cytoskeleton by STED microscopy before determining the distributions of P, S, Fe, Cu and Zn by SXRF spectrometry. We evidenced the colocalization of Zn and microtubules at the dendritic level and a localization of Cu mainly in the neck of dendritic spines rich in F-actin, and a distribution of Fe in the form of very localized points in the dendrites. These results highlight the crucial role of Zn in cytoskeleton architecture of hippocampal neurons and the developed correlative imaging method opens new perspectives for the study of metal dyshomeostasis in neurodegenerative diseases.

Cette thèse porte sur la définition d'un schéma de recalage automatique en microscopie corrélative 2D et 3D, en particulier pour des images de microscopie optique et électronique (CLEM). Au cours des dernières années, la CLEM est devenue un outil d'investigation important et puissant dans le domaine de la bio-imagerie. En utilisant la CLEM, des informations complémentaires peuvent être collectées à partir d'un échantillon biologique. La superposition des différentes images microscopiques est généralement réalisée à l'aide de techniques impliquant une assistance manuelle à plusieurs étapes, ce qui est exigeant et prend beaucoup de temps pour les biologistes. Pour faciliter et diffuser le procédé de CLEM, notre travail de thèse est axé sur la création de méthodes de recalage automatique qui soient fiables, faciles à utiliser et qui ne nécessitent pas d'ajustement de paramètres ou de connaissances complexes. Le recalage CLEM doit faire face à de nombreux problèmes dus aux différences entre les images de microscopie électronique et optique et leur mode d'acquisition, tant en termes de résolution du pixel, de taille des images, de contenu, de champ de vision et d'apparence. Nous avons conçu des méthodes basées sur l'intensité des images pour aligner les images CLEM en 2D et 3D. Elles comprennent plusieurs étapes : représentation commune des images LM et EM à l'aide de la transformation LoG, pré-alignement exploitant des mesures de similarité à partir d'histogrammes avec une recherche exhaustive, et un recalage fin basé sur l'information mutuelle. De plus, nous avons défini une méthode de sélection robuste de modèles de mouvement, et un méthode de détection multi-échelle de spots, que nous avons exploitées dans le recalage CLEM 2D. Notre schéma de recalage automatisé pour la CLEM a été testé avec succès sur plusieurs ensembles de données CLEM réelles 2D et 3D. Les résultats ont été validés par des biologistes, offrant une excellente perspective sur l'utilité de nos développements. / This thesis is concerned with the definition of an automated registration framework for 2D and 3D correlative microscopy images, in particular for correlative light and electron microscopy (CLEM) images. In recent years, CLEM has become an important and powerful tool in the bioimaging field. By using CLEM, complementary information can be collected from a biological sample. An overlay of the different microscopy images is commonly achieved using techniques involving manual assistance at several steps, which is demanding and time consuming for biologists. To facilitate and disseminate the CLEM process for biologists, the thesis work is focused on creating automatic registration methods that are reliable, easy to use and do not require parameter tuning or complex knowledge. CLEM registration has to deal with many issues due to the differences between electron microscopy and light microscopy images and their acquisition, both in terms of pixel resolution, image size, content, field of view and appearance. We have designed intensity-based methods to align CLEM images in 2D and 3D. They involved a common representation of the LM and EM images using the LoG transform, a pre-alignment step exploiting histogram-based similarities within an exhaustive search, and a fine mutual information-based registration. In addition, we have defined a robust motion model selection method, and a multiscale spot detection method which were exploited in the 2D CLEM registration. Our automated CLEM registration framework was successfully tested on several real 2D and 3D CLEM datasets and the results were validated by biologists, offering an excellent perspective in the usefulness of our methods.

Le système de sécrétion type VII (T7SS) présent chez les mycobactéries comporte cinq loci, nommés ESX-1 à ESX-5, chacun possédant leurs propres fonctions. Le système ESX-3, le plus conservé entre les espèces de mycobactéries, participe au transport du fer et à la sécrétion de protéines dont la protéine EsxH. EsxH interagit avec le système ESCRT dans le macrophage et contribue à la persistance de M. tuberculosis (Mtb) dans l’hôte. Afin de mieux comprendre le mécanisme du T7SS, nous avons surexprimé le locus ESX-3 de Mtb dans les organismes recombinants M. smegmatis et M. marinum. Nous avons purifié un coeur protéique partiel du complexe ESX-3 par chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC) et déterminé différentes structures in vitro qui pourraient représenter son dynamisme par une analyse des particules individuelles. Nous avons localisé le complexe ESX-3 aux pôles chez M. marinum par microscopie de fluorescence (fLM) et microscopie super-résolution d’illumination de structure (SR-SIM). Finalement, nous avons reconstruit un modèle in vivo 3D de ce complexe en jumelant une technique de corrélation entre la microscopie par localisation photoactivée (PALM) et la tomographie électronique en conditions cryogéniques (cryo-ET). En jumelant nos structures in vitro et notre modèle in vivo, nous discutons d’un mécanisme possible du complexe ESX-3. Ces analyses pourront aussi supporter le criblage d’inhibiteurs potentiels pour traiter les infection mycobactériennes. / A novel, type VII secretion system (T7SS) was recently discovered in Mycobacteria. Five subsystems, called ESX-1 to ESX-5, have been identified, with the ESX-3 being the most conserved. The ESX-3 system is essential for growth and pathogenesis, and has been implicated in iron transport and secretion of effector proteins into the host. The secreted proteins are shown to prevent phagosome maturation by interacting with the ESCRT machinery of the macrophage. To characterize the structure and mechanism of secretion employed by the T7SS, we use the ESX-3 system from Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and recombinantly express it in M. smegmatis and M. marinum cells. By combining Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) and Single Particle electron microscopy analysis, we have reconstructed several in vitro models that contain at least three of the ESX-3 cluster proteins and may represent the dynamic nature of the core complex. Using fluorescent light microscopy (fLM) and super-resolution structure illumination microscopy (SR-SIM), we localized the ESX-3 complex to the lateral pole in M. marinum cells. We also used super-resolution photoactivated localization microscopy (PALM) in correlation with cryo-electron tomography (cryo-ET) of whole M. marinum cells to localize and reconstruct an in vivo 3D model of the ESX-3 secretion system. By combining the single particle reconstructions and the cryotomography data, we discuss a possible mechanism of ESX-3 secretion. Such analysis may support future inhibitor screens to prevent mycobacterial infections.