Orientadora : Profª. Drª. Elaine Machado Benelli / Coorientadora : Profª. Drª. Cecília Fabiana da Gama Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 16/03/2017 / Inclui referências : f. 33-34 / Resumo: A análise estrutural de proteínas é uma ferramenta de grande importância na biologia moderna, uma vez que possibilita o estudo do mecanismo de ação de diversas doenças e o desenvolvimento de novos medicamentos. Atualmente, a principal técnica utilizada no estudo da estrutura tridimensional de proteínas é a cristalografia de raios-X, sendo responsável pela resolução de cerca de 90% das estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB). Contudo, a difração de raios-X requer a obtenção de um cristal de proteína de alta qualidade. A cristalização de proteínas é um processo que exige condições específicas, envolvendo uma transição de fase na qual as moléculas de proteína deixam de ser solúveis e passam a formar núcleos organizados. Assim, esse processo é limitado pela nucleação, que requer o choque ordenado das moléculas de proteína para dar início ao crescimento do cristal. Esta, por sua vez, necessita que seja atingida a supersaturação das proteínas em solução. Para atingir essa condição utiliza-se mais comumente a técnica de difusão de vapor, na qual ocorre um aumento de concentração de proteína na gota por meio da difusão lenta de água para um reservatório com maior concentração salina. Quando a condição de supersaturação for atingida muito rapidamente, forma-se um precipitado amorfo em vez de cristais ordenados. Além disso, um nível de saturação muito alto pode levar a formação de inúmeros núcleos, desfavorecendo o crescimento dos cristais e prevalecendo cristais pequenos e de baixa qualidade. Na literatura são propostas diversas alternativas para facilitar a nucleação e crescimento dos cristais, que demandam concentrações menores de proteína e menos tempo. Uma alternativa comum é a chamada nucleação heterogênea, em que o meio cristalizante é semeado com materiais minerais ou orgânicos, como micro-cristais da própria proteína. Outra alternativa é a utilização de um campo elétrico, magnético ou eletromagnético para promover a organização das moléculas na solução de proteína. No entanto, muitas dessas metodologias ainda apresentam limitações, sobretudo com relação a qualidade dos cristais formados. Neste contexto, o presente trabalho apresenta uma nova abordagem para promover a nucleação, empregando a aplicação de um campo elétrico externo durante a formação de um filme protéico e a utilização deste filme organizado como centro de nucleação na cristalização por vapor-difusão. Como modelo de estudo foi utilizada a lisozima de clara de ovo de galinha. Através de imagens de microscopia de força atômica foi possível confirmar a estrutura organizada destes filmes e, por espectroscopia de infra-vermelho por transformada de Fourier foram verificadas pequenas alterações na estrutura secundária da proteína diante da aplicação do campo elétrico. Essa alterações, contudo, não comprometeram a estrutura final da proteína, permitindo um aumento no número de cristais formados, e, em alguns casos, uma melhora da morfologia e aumento do tamanho destes cristais. A análise por difração de raios-X indicou uma melhoria na qualidade da estrutura cristalina, sobretudo em condições nas quais tradicionalmente não se obtêm bons cristais de lisozima. Palavras-chave: cristalização de proteínas, filme organizado de proteína, lisozima, nucleação. / Abstract: Structural analysis of proteins is a tool of great importance in modern biology, since it allows the study of the mechanism of action of several diseases and the design of new drugs. Nowadays, the main technique used in the study of the three-dimensional structure of proteins is X-ray crystallography, being responsible for the resolution of about 90% of the structures deposited in the Protein Data Bank (PDB). However, X-ray diffraction requires a protein crystal of high quality. The protein crystallization is a process that demands specific conditions involving a transition phase in which protein molecules are no longer soluble and start to form organized nuclei. Thus, this process is limited by nucleation, which requires ordered shock of protein molecules to initiate crystal growth. This, in turn, needs to achieve supersaturation of proteins in solution. In order to reach this condition, the technique of vapor diffusion is used, in which an increase of protein concentration in the drop occurs through the slow diffusion of water to a reservoir with higher salt concentration. When the supersaturation condition is reached very quickly, an amorphous precipitate is formed instead of ordered crystals. In addition, a very high saturation level can lead to the formation of numerous nuclei, disfavoring the growth of crystals and prevailing small and low quality crystals. In the literature, several alternatives are proposed to facilitate nucleation and crystal growth, requiring lower protein concentrations and less time. A common alternative is the so-called heterogeneous nucleation, where the crystallizing medium is seeded with mineral or organic materials, such as microcrystals of the protein itself. Another alternative is the use of an electric, magnetic or electromagnetic field to promote the organization of molecules in the protein solution. However, many of these methods still have limitations, especially regarding to the quality of the crystals formed. In this context, the present work presents a new approach to promote nucleation, employing the application of an external electric field during the formation of a protein film and the use of this organized film as nucleation center in the vapor diffusion crystallization. The chicken egg white lysozyme was used as the study model. Through atomic force microscopy images it was possible to confirm the organized structure of these films, and with Fourier transform infrared spectroscopy were observed small changes in protein secondary structure when the electric field was applied. These changes, however, did not compromise the final structure of the protein, allowing an increase in the number of crystals formed, and, in some cases, an improvement in the morphology and size increase of these crystals. The X-ray diffraction analysis indicated an improvement in the quality of the crystalline structure, especially under conditions in which good crystals of lysozyme are traditionally not obtained. Keywords: protein crystallization, protein organized film, lysozyme, nucleation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/53038 |
| Date | January 2017 |
| Creators | Walter, Tássia Karina |
| Contributors | Ferreira, Cecilia Fabiana da Gama, Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica), Benelli, Elaine Machado |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 56 f. : il., gráfs., tabs., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | Disponível em formato digital |
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