Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Trypanosomatid protozoa of Leishmania genus are vector-borne parasites that infect humans causing a wide range of diseases known as Leishmaniasis. Severity of clinical forms generally depends on infecting species, thus its correct identification becomes critical to diagnosis, prognosis and treatment. The current biochemical and molecular methods for typing strains of Leishmania species are mostly effective. Although these tools remain important in the diagnosis and identification of Leishmania, they are insufficient for definitive identification. After isolate 7 clinical parasites strains, some of them belonging to atypical cases of cutaneous/mucocutaneous and visceral Leishmaniasis, we aimed to identify the specie of Leishmania involved in these cases. By combining structural analysis of the body shape, such as presence of flagellum and kinetoplast, we saw that these parasites shared morphologic characteristics with others Tripanosomatidae, however, they were not conclusive for species identification. Since PCR and isozymes assays were unsuccessful to identify 6 out of 7 clinical isolates reported here, we proceeded to determine their genome sequence. Through whole-genome sequencing analysis of parasite strains, we showed that a new pathogenic Trypanosomatid was the etiological agent in clinical cases diagnosed as Leishmaniasis in Brazil. By comparing coding sequences of over orthologous genes within 36 Trypanosomatidae organisms, we found that this new parasite is closely related to Crithidia fasciculata, which parasites exclusively mosquitoes and is considered non-infective to humans. Phenotypic characterization of 2 of these isolates from the skin and bone marrow of the same patient showed that skin isolate was attenuated compared to the bone marrow isolate for survival in the spleen in BALB/c mice. However, both of them were able to infect and induce inflammation in the liver after 4 and 6 weeks post infection. Conversely, only skin isolate was able to survive in dermis, leading to ear swelling, accompanied of presence of parasites in the ear and lymph nodes. Besides that, bone marrow isolate infection in murine macrophages showed higher number of infected cells and also increased number of parasites within macrophages comparing to the skin isolate infection. Furthermore, bone marrow isolate negatively modulated the nitric oxide production in murine macrophages, corroborating with increased infection. Our findings raise concerns about an emerging infectious disease easily confused with Leishmaniasis, opening a research path towards epidemiological questions about identification of vectors, reservoirs, distribution and reassessment of Leishmaniasis cases in Brazil. Due to its proximity to the monoxenous Crithidia genus and the geographical location of atypical Leishmaniasis cases reported here, we proposed naming this new parasite species as Cridia sergipensis. Overall, this research provides a unique knowledge on phenotipic differences associated with diverse pathologies caused by Cridia infection. / Protozoários Tripanossomatídeos do gênero Leishmania são parasitos transmitidos por vetores que infectam hospedeiros vertebrados, causando um amplo espectro de doenças denominadas leishmanioses. A gravidade das formas clínicas depende, dentre outros fatores, da espécie, assim, a identificação correta se torna crítica para o diagnóstico, prognóstico e tratamento. As ferramentas bioquímicas e moleculares disponíveis para caracterizar espécies de Leishmania são, na maioria das vezes, eficientes. Embora essas metodologias sejam importantes para o diagnóstico e identificação de Leishmania, são insuficientes para identificação conclusiva. Após isolar 7 amostras clínicas de parasitos, sendo alguns deles de casos atípicos de leishmaniose cutânea/mucocutânea e visceral, o principal objetivo foi identificar a espécie de Leishmania envolvida. Através da análise estrutural do citoesqueleto, que envolve a presença de flagelo e cinetoplasto, por exemplo, foi observado que esses parasitos compartilham características morfológicas com outros Tripanossomatídeos, entretanto, não se pode afirmar qual a espécie em questão. Uma vez que os resultados da identificação por PCR e eletroforese de isoenzimas foram inconclusivos, foi realizado o sequenciamento total do genoma. O sequenciamento dos isolados clínicos dos pacientes diagnosticados com leishmanioses mostrou que se trata de uma nova espécie patogênica dentro do grupo dos Tripanossomatídeos. Ao comparar as sequências codificantes dos genes ortólogos de 36 Tripanossomatídeos, foi observado que esses parasitos são intimamente relacionados com Crithidia fasciculata, parasito exclusivo de mosquitos, e considerado não patogênico para humanos. A caracterização fenotípica de 2 desses isolados clínicos, sendo um deles isolado da pele e outro da medula óssea do mesmo paciente mostrou que o isolado da pele não foi capaz de estabelecer doença no baço de camundongos BALB/c infectados. Por outro lado, ambos os isolados infectaram e induziram reação inflamatória no fígado dos animais após 4 e 6 semanas de infecção. No entanto, apenas o isolado da pele foi capaz de sobreviver na derme dos camundongos, induzindo inflamação local com presença de parasitos na orelha e linfonodos. Além disso, a infecção com o isolado da medula óssea em macrófagos murinos exibiu um maior número de células infectadas e maior número de amastigotas dentro das células, comparada ao da pele. Adicionalmente, o isolado da medula óssea foi capaz de modular negativamente a produção de óxido nítrico em macrófagos murinos, corroborando com o aumento da infecção. Essas descobertas levantam preocupações sobre uma doença infecciosa emergente facilmente confundida com leishmaniose, abrindo caminhos para a pesquisa nos campos epidemiológicos, de vetores, reservatórios, distribuição e reavaliação de casos de leishmaniose. Devido a proximidade com os parasitos do gênero Crithidia e a localização geográfica de onde foram isolados, a nomenclatura de Cridia sergipensis foi proposta para agrupar essa nova espécie. O presente estudo contribui também para o conhecimento das diferenças fenotípicas associadas com as diversas patologias causadas pela infecção com Cridia. / Aracaju
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:ri.ufs.br:riufs/7637 |
| Date | 28 February 2018 |
| Creators | Santana, Alynne Karen Mendonça de |
| Contributors | Almeida, Roque Pacheco de, Silva, João Santana da |
| Publisher | Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Sergipe |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFS, instname:Universidade Federal de Sergipe, instacron:UFS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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