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Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A hepatite A é uma doença endêmica no Brasil e na América Latina. A
prevalência da infecção tem correlação com precárias condições de higiene e
saneamento. Em países em desenvolvimento, um saneamento inadequado
resulta em maior transmissão desta doença, principalmente entre crianças e
jovens. Atualmente, devido às melhorias das condições sanitárias, o perfil
epidemiológico da doença está se deslocando para idades mais avançadas, o
que facilita a ocorrência de surtos epidemiológicos. Os kits comerciais para
detecção de anti-HAV total normalmente utilizam imunoglobulina G (IgG) de
mamíferos no período convalescente da doença para a produção dos
anticorpos de captura e do conjugado. Uma alternativa à aplicação dos
anticorpos de mamíferos no diagnóstico é o uso da imunoglobulina Y (IgY),
encontrada no soro e gema dos ovos de aves e répteis. Essas proteínas têm
varias vantagens quando comparadas com IgG: alta resposta contra antígenos
de mamíferos, redução da cor de fundo em ensaios imunoenzimáticos e de
serem obtidas por um método não-invasivo (coleta da gema dos ovos). O
objetivo deste trabalho foi a obtenção de anticorpos IgY anti-HAV produzidos
em galinhas imunizadas contra o vírus da Hepatite A (HAV) e o
desenvolvimento de um ensaio imunoenzimático para detecção de anti-HAV
total utilizando IgY anti-HAV como imunoglobulinas de captura e conjugado.
Cinco grupos de galinhas foram imunizadas com diferentes inóculos contendo:
vacina com e sem o adjuvante CpG-ODN, HAV com adjuvante incompleto de
Freund (IFA) com e sem o adjuvante CpG-ODN e um grupo controle com IFA.
Os ovos foram coletados e a gema foi purificada pela precipitação com
polietileno glicol. A solução purificada contendo IgY anti-HAV foi avaliada para
determinação da concentração da IgY anti-HAV por espectrofotometria e sua
especificidade e título foram determinados à partir de um teste
imunoenzimático. Os anticorpos foram conjugados com a peroxidase e foi
estabelecida a diluição ideal para os anticorpos de captura e conjugado. Para
avaliar o ensaio imunoenzimático “in-house” com IgY anti-HAV, foi avaliado um
painel composto de 100 amostras positivas e 100 amostras negativas para anti-
HAV-total. A presença da IgY anti-HAV nas gemas dos ovos foi confirmada por
SDS-PAGE e Western Blotting, e após a purificação, a média da concentração
de proteínas nas gemas dos ovos foi de 8,7406 mg /mL. O grupo imunizado
com HAV, IFA e CPG-ODN apresentou os maiores títulos de anticorpo. O
ensaio “in-house” apresentou sensibilidade de 84%, especificidade de 79% e
eficiência de 81,5%. Os métodos utilizados para a produção de IgY anti-HAV e
sua conjugação com peroxidase foram eficientes e o ensaio imunoenzimático
“in-house” IgY anti-HAV demonstrou uma boa sensibilidade e especificidade. A
produção de anti-HAV IgY apresenta vantagens quando comparado com
obtenção da IgG anti-HAV. O teste imunoenzimático “in house” com IgY anti-
HAV pode ser uma alternativa a utilização da IgG nos ensaios
imunoenzimáticos. / Hepatitis A is an endemic disease in Brazil and Latin America.
Prevalence of this infection is related to the low degree of hygiene and
sanitation. In developing countries, inadequate sanitation results in larger
transmission of the disease mostly in children and young people. Nowadays,
due to better sanitation conditions, the epidemiological profile of disease is
changing to older ages resulting in the occurrence of outbreaks. Diagnostic kits
for detection of total anti-HAV generally use mammals immunoglobulin G (IgG)
in the convalescent period of disease for production of capture and conjugated
antibodies. One alternative to the application of mammals antibodies in the
diagnosis is the use of immunoglobulin Y (IgY), encountered in birds and
reptiles. These proteins have several advantages when compared to IgG: high
response against mammals antigens, reduction of the background in
imunoenzymatic assays and it is obtained by a non-invasive method (harvest of
the egg yolks). The objective of this work was the acquisition of anti-HAV IgY
antibodies produced in immunized chickens against Hepatitis A virus and the
development of an immunoenzymatic assay for total anti-HAV detection using
IgY anti-HAV as capture and conjugated immunoglobulins. Five groups of
chickens were immunized with different inocula containing: vaccine with and
without CpG-ODN adjuvant, HAV with incomplete Freund adjuvant (IFA) with
and without CpG-ODN and one control group with IFA. The eggs were
harvested and the yolk was purified by precipitation with polyethylene glycol.
The purified solution containing anti-HAV IgY was evaluated by
espectrofotometry and their specificity and title were determined by an
immunoenzymatic assay. These antibodies were conjugated with peroxidase
and was estabilized the ideal dilution for capture and conjugated antibodies. For
evaluation of the immunoenzymatic “in-house” assay with IgY anti-HAV, a panel
composed of 100 positive samples and 100 negative samples for total anti-HAV
was assessed. The presence of IgY anti-HAV in egg yolks was established by
SDS-PAGE and Western Blotting, and after the purification, the average of the
proteins concentrations in the egg yolks was of 8,7406 mg/mL. The group
immunized with HAV, IFA and CpG-ODN demonstrate the higher titer of
antibodies. The “in-house” assay showed sensibility of 84%, specificity of 79%
and efficiency of 81,5%. The methods used for anti-HAV IgY production and
conjugation with peroxidase were efficient and the “in-house” immunoenzymatic
assay IgY anti-HAV demonstrated a good sensitivity and specificity. The
production of IgY anti-HAV showed advantages when compared to the
acquisition of IgG anti-HAV. The immunoenzymatic “in-house” assay IgY anti-
HAV can be an alternative to the utilization of IgG in immunoenzymatic assays.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/4091 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Silva, Alexandre dos Santos da |
| Contributors | Villar, Livia Melo, Santos, Flavia Barreto dos, Castro, Ana Rita Coimbra Motta de, Araujo, Natalia Motta de, Almeida, Adilson José de, Paula, Vanessa Salete de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Alexandre dos Santos da Silva, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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