Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-23T19:07:54Z No. of bitstreams: 1 ana_carolina_ga_teixeira_ioc_bp_0014_2010.pdf: 1653062 bytes, checksum: c8bcad08106fd76eb4c45a58831e4f12 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-23T19:07:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana_carolina_ga_teixeira_ioc_bp_0014_2010.pdf: 1653062 bytes, checksum: c8bcad08106fd76eb4c45a58831e4f12 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) FIOCRUZ / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os Rotavirus A (RV-A) são os principais causadores de gastroenterites em crianças menores de cinco anos de idade. Estes vírus estão diretamente associados à diarréia e vômito e são transmitidos pela propagação de pessoa a pessoa por via fecal-oral; entretanto, a transmissão ambiental de RV-A pelo contato com superfícies contaminadas tem sido descrita em hospitais. O objetivo deste estudo foi estabelecer um protocolo para detecção de RV-A em superfícies e fômites, a fim de avaliar o RV-A como marcador biológico de contaminação de superfícies hospitalares. Um estudo piloto foi realizado para avaliação e determinação da metodologia de recuperação viral a ser utilizada em estudo no Centro de Tratamento Intensivo de um hospital da rede particular situado na cidade do Rio de Janeiro, Brasil. Neste local, no período de janeiro a junho de 2009, foram realizadas coletas mensais de 12 superfícies e fômites de 7 leitos do CTI, totalizando 504 amostras provenientes de: suporte para álcool gel, botão de descarga, cadeira do acompanhante, suporte de clorexidina, tampa da lixeira de resíduos comuns, maçaneta interna da porta do leito, controle da cama, maçaneta externa do banheiro, teclado da bomba de infusão, controle remoto, mesa de apoio e telefone. As amostras foram obtidas por fricção de ―swabs” embebidos em meio de cultura (DMEM) e a extração do ácido nucléico viral realizada pelo método de isotiocianato de guanidina/sílica, seguida da síntese do cDNA utilizando iniciador randômico (pdN6). Protocolos de reação em cadeia da polimerase (PCR) qualitativa e quantitativa foram utilizados para detecção e quantificação do RV-A pela amplificação parcial dos genes que codificam para a proteína estrutural VP6 e a não estrutural NSP3, respectivamente. Das 504 amostras analisadas, 25 (5%) foram positivas para RV-A pela RT-PCR, ao passo que pela Nested-PCR este número aumentou para 73 (14,5%). Destas 45 (61,6%) foram quantificadas pela qPCR com carga viral variando de 3,4 x 100cg/mL a 2,9 x 103cg/mL. O sequenciamento nucleotidico dos produtos obtidos pela nested-RT-PCR confirmaram a contaminação por RV-A. A detecção de RV-A em superfícies hospitalares aponta para a necessidade de um maior controle de higienização que reduza a contaminação por vírus, e sugere a utilização do RV-A como marcador biológico de contaminação de superfícies hospitalares. / Rotavirus A (RV-A) is the main cause of acute gastroenteritis in children under five years of age. This virus is directly associated with diarrhea and vomiting and is transmitted by spread from person to person by the fecal-oral route, however, environmental transmission of RV-A by contact with contaminated surfaces has been described in hospitals. The aim of this study was to establish a protocol for detection of RV-A on surfaces and fomites in order to assess RV-A as a contamination biomarker of hospital surfaces. A pilot study was performed for evaluation and determination of viral recovery methods to be used in a study in the intensive care unit (ICU) of a private hospital located in the city of Rio de Janeiro, Brazil. From January to June/2009, samples were collected monthly from 12 surfaces and fomites of 7-bed of the ICU. There was a total of 504 samples collected from the following sites: alcohol gel and chlorhexidine dispensers, toilet flush button, chair from the accompanying person, ordinary waste bin lid, door handle from outside the bathroom door and the patient’s room, bed control, infusion pump keyboard, TV remote control, desk and telephone. Samples were obtained by rubbing swabs embedded in culture medium (DMEM). Viral nucleic acid extraction was performed by the method of guanidine isothiocyanate / silica, followed by cDNA synthesis using random primer (pdN6). Qualitative and quantitative polymerase chain reaction (PCR) were used for detection and quantification of RV-A by partial amplification of genes coding for the structural protein VP6 and nonstructural protein NSP3, respectively. Of the 504 analyzed samples, 25 (5%) were positive for RV-A by RT-PCR; when nested-PCR was used, the number increased to 73 (14.5%). Of these, 45 (61.6%) were quantified by quantitative PCR with viral load ranging from 3.4 x 100cg/mL to 2.9 x 103cg/mL. Nucleotide sequences of the products obtained by nested-RT-PCR confirmed RV-A contamination. Detection of RV-A in hospital surfaces indicates the need of greater control on cleaning procedures to reduce contamination by viruses and suggests using RV-A as a possible biomarker for contamination of hospital surfaces.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-21T19:40:25Z No. of bitstreams: 1 alexandre_santos_silva_ioc_bp_0011_2010.pdf: 1220834 bytes, checksum: e61580079e61e5f06f901abb6feddfb9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-21T19:40:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alexandre_santos_silva_ioc_bp_0011_2010.pdf: 1220834 bytes, checksum: e61580079e61e5f06f901abb6feddfb9 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A hepatite A é uma doença endêmica no Brasil e na América Latina. A prevalência da infecção tem correlação com precárias condições de higiene e saneamento. Em países em desenvolvimento, um saneamento inadequado resulta em maior transmissão desta doença, principalmente entre crianças e jovens. Atualmente, devido às melhorias das condições sanitárias, o perfil epidemiológico da doença está se deslocando para idades mais avançadas, o que facilita a ocorrência de surtos epidemiológicos. Os kits comerciais para detecção de anti-HAV total normalmente utilizam imunoglobulina G (IgG) de mamíferos no período convalescente da doença para a produção dos anticorpos de captura e do conjugado. Uma alternativa à aplicação dos anticorpos de mamíferos no diagnóstico é o uso da imunoglobulina Y (IgY), encontrada no soro e gema dos ovos de aves e répteis. Essas proteínas têm varias vantagens quando comparadas com IgG: alta resposta contra antígenos de mamíferos, redução da cor de fundo em ensaios imunoenzimáticos e de serem obtidas por um método não-invasivo (coleta da gema dos ovos). O objetivo deste trabalho foi a obtenção de anticorpos IgY anti-HAV produzidos em galinhas imunizadas contra o vírus da Hepatite A (HAV) e o desenvolvimento de um ensaio imunoenzimático para detecção de anti-HAV total utilizando IgY anti-HAV como imunoglobulinas de captura e conjugado. Cinco grupos de galinhas foram imunizadas com diferentes inóculos contendo: vacina com e sem o adjuvante CpG-ODN, HAV com adjuvante incompleto de Freund (IFA) com e sem o adjuvante CpG-ODN e um grupo controle com IFA. Os ovos foram coletados e a gema foi purificada pela precipitação com polietileno glicol. A solução purificada contendo IgY anti-HAV foi avaliada para determinação da concentração da IgY anti-HAV por espectrofotometria e sua especificidade e título foram determinados à partir de um teste imunoenzimático. Os anticorpos foram conjugados com a peroxidase e foi estabelecida a diluição ideal para os anticorpos de captura e conjugado. Para avaliar o ensaio imunoenzimático “in-house” com IgY anti-HAV, foi avaliado um painel composto de 100 amostras positivas e 100 amostras negativas para anti- HAV-total. A presença da IgY anti-HAV nas gemas dos ovos foi confirmada por SDS-PAGE e Western Blotting, e após a purificação, a média da concentração de proteínas nas gemas dos ovos foi de 8,7406 mg /mL. O grupo imunizado com HAV, IFA e CPG-ODN apresentou os maiores títulos de anticorpo. O ensaio “in-house” apresentou sensibilidade de 84%, especificidade de 79% e eficiência de 81,5%. Os métodos utilizados para a produção de IgY anti-HAV e sua conjugação com peroxidase foram eficientes e o ensaio imunoenzimático “in-house” IgY anti-HAV demonstrou uma boa sensibilidade e especificidade. A produção de anti-HAV IgY apresenta vantagens quando comparado com obtenção da IgG anti-HAV. O teste imunoenzimático “in house” com IgY anti- HAV pode ser uma alternativa a utilização da IgG nos ensaios imunoenzimáticos. / Hepatitis A is an endemic disease in Brazil and Latin America. Prevalence of this infection is related to the low degree of hygiene and sanitation. In developing countries, inadequate sanitation results in larger transmission of the disease mostly in children and young people. Nowadays, due to better sanitation conditions, the epidemiological profile of disease is changing to older ages resulting in the occurrence of outbreaks. Diagnostic kits for detection of total anti-HAV generally use mammals immunoglobulin G (IgG) in the convalescent period of disease for production of capture and conjugated antibodies. One alternative to the application of mammals antibodies in the diagnosis is the use of immunoglobulin Y (IgY), encountered in birds and reptiles. These proteins have several advantages when compared to IgG: high response against mammals antigens, reduction of the background in imunoenzymatic assays and it is obtained by a non-invasive method (harvest of the egg yolks). The objective of this work was the acquisition of anti-HAV IgY antibodies produced in immunized chickens against Hepatitis A virus and the development of an immunoenzymatic assay for total anti-HAV detection using IgY anti-HAV as capture and conjugated immunoglobulins. Five groups of chickens were immunized with different inocula containing: vaccine with and without CpG-ODN adjuvant, HAV with incomplete Freund adjuvant (IFA) with and without CpG-ODN and one control group with IFA. The eggs were harvested and the yolk was purified by precipitation with polyethylene glycol. The purified solution containing anti-HAV IgY was evaluated by espectrofotometry and their specificity and title were determined by an immunoenzymatic assay. These antibodies were conjugated with peroxidase and was estabilized the ideal dilution for capture and conjugated antibodies. For evaluation of the immunoenzymatic “in-house” assay with IgY anti-HAV, a panel composed of 100 positive samples and 100 negative samples for total anti-HAV was assessed. The presence of IgY anti-HAV in egg yolks was established by SDS-PAGE and Western Blotting, and after the purification, the average of the proteins concentrations in the egg yolks was of 8,7406 mg/mL. The group immunized with HAV, IFA and CpG-ODN demonstrate the higher titer of antibodies. The “in-house” assay showed sensibility of 84%, specificity of 79% and efficiency of 81,5%. The methods used for anti-HAV IgY production and conjugation with peroxidase were efficient and the “in-house” immunoenzymatic assay IgY anti-HAV demonstrated a good sensitivity and specificity. The production of IgY anti-HAV showed advantages when compared to the acquisition of IgG anti-HAV. The immunoenzymatic “in-house” assay IgY anti- HAV can be an alternative to the utilization of IgG in immunoenzymatic assays.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-23T17:52:57Z No. of bitstreams: 1 aline_f_galvao_ioc_bp_0012_2010.pdf: 3755366 bytes, checksum: 56aff28b3b15de796039925e6364d082 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-23T17:52:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 aline_f_galvao_ioc_bp_0012_2010.pdf: 3755366 bytes, checksum: 56aff28b3b15de796039925e6364d082 (MD5) Previous issue date: 2010 / CNPq/Fiocruz - FAPERJ/Fiocruz / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / A esquistossomose é uma das doenças parasitárias mais prevalentes no mundo, sendo a quimioterapia com praziquantel (PZQ) a principal estratégia adotada para seu controle. No entanto, faltam informações sobre o impacto da quimioterapia com PZQ sobre a infecção por Schistosoma mansoni nas condições enfrentadas pelos programas de controle, e ainda não há prova de princípio sobre o melhor regime de dosagem a ser utilizado. Um ensaio clínico randomizado duplo-cego foi realizado com o objetivo de avaliar o impacto do tratamento em dose única de PZQ 60 mg/kg na infecção por S. mansoni comparado à dose padrão de PZQ 40 mg/kg em adolescentes do município de São Lourenço da Mata. Um inquérito coproscópico preliminar selecionou indivíduos para a triagem e aqueles que se adequaram aos critérios de inclusão/exclusão foram recrutados e tratados com dose única de 40 mg/kg ou 60 mg/kg de PZQ. Inquéritos coproscópicos de acompanhamento foram realizados aos 21, 180 e 360 dias pós-tratamento. A prevalência e a intensidade de infecção foram comparadas nos quatro momentos do estudo nos dois grupos de tratamento utilizando tabelas de contingência (Qui-quadrado ou teste exato de Fisher) e ANOVA. A influência de outras variáveis no estudo foi avaliada através da análise de regressão logística. Um levantamento malacológico foi realizado para verificar a infecção natural da espécie hospedeira local, Biomphalaria straminea. A análise da distribuição espacial da infecção nos dois grupos antes e depois (180 e 360 dias) do tratamento foi realizada pela estimativa de densidade de kernel para a detecção de aglomerados de casos. Ao todo, 123 adolescentes (10-19 anos) de São Lourenço da Mata, PE, com mais de 100 ovos por grama de fezes foram examinados nos quatro momentos do estudo. Embora todos os pacientes estivessem negativos 21 dias após o tratamento, 17,9% e 30,9% estavam positivos após 180 e 360 dias, respectivamente. Tanto a prevalência quanto a intensidade de infecção após o tratamento foram significativamente maiores (P < 0,05) no regime de 40 mg/kg do que no de 60 mg/kg. Os sujeitos do sexo masculino e os que foram tratados com PZQ 40 mg/kg tiveram uma chance significativamente maior de estarem positivos 360 dias pós-tratamento. As taxas de infecção natural mensais de B. straminea variaram de 0 a 2,2%. Os aglomerados de prevalência de infecção aos 180 e aos 360 dias tiveram maior densidade e extensão nos sujeitos tratados com 40 mg/kg do que nos tratados com 60 mg/kg. Recomenda-se a dose de PZQ 60 mg/kg para o tratamento dos portadores da infecção por S. mansoni em áreas endêmicas no Brasil, já que, embora tanto a terapia com dose única de PZQ 40 mg/kg quanto com 60 mg/kg tenham tido um impacto alto e comparável na infecção 21 dias após o tratamento, os sujeitos que receberam a dose maior foram capazes de manter níveis significativamente mais baixos tanto de prevalência quanto de intensidade de infecção por até um ano após o tratamento. Os resultados espaciais confirmam os dados parasitológicos e reforçam a necessidade de que medidas preventivas auxiliares sejam integradas com a quimioterapia para se obter um impacto maior sobre o controle da doença. / Schistosomiasis is one of the most prevalent parasitic diseases in the world, and chemotherapy with praziquantel (PZQ) is the main strategy for its control. However, information about the impact of chemotherapy with PZQ on Schistosoma mansoni infection under conditions faced by control programmes is missing, and there is no proof of principle about the best dosing regimen to be used. A randomized, double- blind clinical trial was conducted to evaluate the impact of treatment with the single dose 60 mg/kg PZQ on S. mansoni infection compared to the standard dose of 40 mg/kg PZQ in adolescents from the municipality of São Lourenço da Mata. A preliminary parasitological survey selected individuals for screening and those who filled the inclusion/exclusion criteria were recruited and treated with either 40 mg/kg or 60 mg/kg single dose PZQ. Follow-up stool surveys were performed at 21, 180 and 360 days post-treatment. Prevalence and intensity of infection were compared between treatment groups in the four assessments using contingency tables analysis and Analysis of Variance, respectively. The influence of other variables in the study was assessed by logistic regression analysis. A snail survey was conducted to verify the natural infection rates of the local intermediate host species, Biomphalaria straminea. Spatial analysis of infection in both groups before and after treatment was performed by estimating the kernel density for the detection of clusters of positive cases. Altogether, 123 adolescents (10-19 years) from São Lourenço da Mata, PE, with more than 100 eggs per gram of feces were examined in the four assessments. Although all patients were negative 21 days after treatment, 17.9% and 30.9% were positive at 180 and 360 days, respectively. Both prevalence and intensity of infection after treatment were significantly higher (P <0.05) in the 40 mg/kg regime than in the 60 mg/kg one. The male subjects and those who were treated with 40 mg/kg had a significantly higher chance of being positive 360 days post-treatment than those treated with 60 mg/kg. The monthly infection rates of B. straminea ranged from 0 to 2.2%. Clusters of positive subjects treated with 40 mg/kg had a higher density and extent than those treated with 60 mg/kg both at 180 and 360 days. It is recommended that the 60 mg/kg PZQ dose should be maintained for treatment of S. mansoni infection in endemic areas in Brazil, as both therapy with 40 mg/kg or 60 mg/kg PZQ single doses had a high and comparable impact on infection 21 days after treatment and subjects who received the higher dose were able to maintain lower levels of both prevalence and intensity of infection for up to one year after treatment. The spatial results confirm the parasitological data and reinforce the need of auxiliary, preventive measures integrated with chemotherapy to achieve a greater impact on disease control.