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Previous issue date: 2017-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Enzymes of the xylanolytic complex, from microorganisms, have been an
increasingly important biotechnological tool mainly in industrial processes that require
high temperatures, such as in the baking industry, animal feed, textile, pulp and
cellulose. Among the fungi producing thermostable enzymes, Thermomyces
lanuginosus has been evidenced as a good producer of xylanases. In this context,
xylanase from the recently isolated thermophilic fungus of the Paraná Atlantic Forest,
T. lanuginosus, was purified, biochemically characterized, as well as a structureactivity
correlation study of the enzyme was investigated through circular dichroism
and fluorescence spectroscopy. Extracellular xylanase was purified after four steps of
ion exchange chromatographic columns and molecular filtration. The purity and
molecular mass (21.3 kDa) of the enzyme were determined by SDS-PAGE and
MALDI-TOF/MS. The xylanase is highly specific to the beechwood xylan substrate
and generated mainly xylobiose (X2) and xylotriose (X3), products characteristic of
the action of endoxylanase. The enzyme was able to cleave the xylooligosaccharides
xylotetraose and xylopentaose, except xylobiose and xylotriose. It
exhibit higher activity at pH 6.5 and temperature of 75°C, with stability between pH
5.0-8.0 for 100 hours and thermostability between 40 and 75°C for 5 hours. The
deconvolution of the circular dichroism spectrum (CD) enzyme revealed a secondary
conformation rich in β-structures with transition midpoint temperature (Tm) of 73.0
0.2°C. In this structural study, xylanase reveals that to perform high enzymatic
activity, it was necessary a conformational change. Its secondary structure is
conserved even at pH extremes at temperatures up to 70°C and in the presence of
MnCl2 (1 mM), DTT (5 mM) and high concentration of guanidine (6 M). Intrinsic
fluorescence reveals that the tertiary structure is influenced by pH, guanidine (1 M)
associated with temperature and in the presence of MnCl2 and DTT, whereas
extrinsic fluorescence, using the ANS probe, shows changes in pH extremes and in
the presence of MnCl2 and DTT. Fluorescence results suggest that both the
increased enzymatic activity in the presence of cofactors and the loss of activity at
extreme pH values are related to changes in the tertiary structure of the enzyme.
Thus, T. lanuginosus xylanase has interesting biochemical characteristics for
application in several industrial sectors that mainly use high temperature conditions. / As enzimas do complexo xilanolítico, provenientes de microrganismos, têm se
tornado uma ferramenta biotecnológica cada vez mais importante, principalmente
em processos industriais que requerem temperaturas elevadas, como na indústria
de panificação, de rações animais, têxtil, polpa e celulose. Dentre os fungos
produtores de enzimas termoestáveis, Thermomyces lanuginosus tem se destacado
como bom produtor de xilanases. Nesse contexto, a xilanase do fungo termofílico
recentemente isolado da Mata Atlântica do Paraná, T. lanuginosus, foi purificada,
caracterizada bioquimicamente, bem como um estudo de correlação estruturaatividade
da enzima foi investigado através das espectroscopias de dicroísmo
circular e fluorescência. A xilanase extracelular foi purificada após quatro etapas
cromatográficas envolvendo colunas de troca iônica e filtração molecular. A pureza e
massa molecular (21,3 kDa) da enzima foram determinadas por SDS-PAGE e
MALDI-TOF/MS. A xilanase é altamente específica para o substrato xilano de
beechwood e gerou principalmente xilobiose (X2) e xilotriose (X3), produtos
característicos da ação de endoxilanase. A enzima foi capaz de clivar os xilooligossacarídeos
xitotetraose e xilopentaose, exceto a xilobiose e xilotriose. Exibe
maior atividade em pH 6,5 e temperatura de 75°C, com estabilidade entre os pH
5,0-8,0 durante 100 horas e termoestabilidade entre 40 e 75°C durante 5 horas. A
deconvolução do espectro de dicroísmo circular (CD) da enzima revela uma
conformação secundária rica em estruturas-β, com temperatura do ponto médio da
transição (Tm) de 73,0 0,2°C. Neste estudo estrutural, a xilanase revelou que, para
desempenhar elevada atividade enzimática, foi necessário ocorrer mudança
conformacional. Sua estrutura secundária é conservada mesmo em extremos de pH,
em temperaturas até 70°C e na presença de MnCl2 (1 mM), DTT (5 mM) e elevada
concentração de guanidina (6 M). A fluorescência intrínseca revela que a estrutura
terciária sofre influência do pH, guanidina (1 M) associado à temperatura e na
presença de MnCl2 e DTT, enquanto a fluorescência extrínseca, utilizando a sonda
ANS, revela mudanças em extremos de pH e na presença de MnCl2 e DTT. Os
resultados da fluorescência sugerem que tanto o aumento da atividade enzimática
na presença dos cofatores quanto a perda da atividade em valores extremos de pH
relacionam-se às alterações da estrutura terciária da enzima. Dessa forma, a
xilanase de T. lanuginosus possui características bioquímicas interessantes para
aplicação em diversos setores industriais que utilizam principalmente condições de temperatura elevada.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.unioeste.br:tede/2962 |
| Date | 07 February 2017 |
| Creators | Torre, Carla Lieko Della |
| Contributors | Kadowaki, Marina Kimiko, Lucca, Rosemeire Aparecida da Silva de, Maller, Alexandre, Oliva, Maria Luiza Vilela, Kadowaki, Marina Kimiko |
| Publisher | Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, 6588633818200016417, 500, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, UNIOESTE, Brasil, Centro de Ciências Médicas e Farmacêuticas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do UNIOESTE, instname:Universidade Estadual do Oeste do Paraná, instacron:UNIOESTE |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 7878055067573953101, 600, 600, 600, 600, -8940439713387849267, 6997636413449754996, 2075167498588264571 |
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