The fluorescence spectroscopy and lifetime analysis in biological tissues has been presented as a technique of great potential for tissue characterization for diagnostic purposes. This potential is due to the main advantages of optical techniques based on fluorescence for diagnosis, which includes the possibility of evaluating the tissue metabolism in situ, without removal and processing of the biological sample, through a fast and non-invasive response. Skin lesions were the target interrogated tissue in the present study. They can be clinically classified into two major groups: pigmented and non-pigmented lesions. In each group, the clinical discrimination of benign and malignant lesions may be a complex task, especially for non-experienced clinicians. When these lesions have clinically similar features, the choice of the treatment modality becomes difficult. In this context, auxiliary diagnostic techniques are very important to improve the diagnostic resolution as well as treatment planning and success. Gold standard for skin diagnosis is obtained with the biopsy and further histological analysis. The information about these features is invasive and time consuming. When using a non-invasive procedure such as fluorescence lifetime measurements, the main interrogated fluorophores are NADH (nicotinamide adenine dinucleotide) and FAD (flavin adenine dinucleotide), biomolecules involved in cellular respiration that may provide information on the metabolism of the cells. To differentiate each skin lesion, it is necessary to take into account the contribution of endogenous fluorophores emission such as collagen and elastin, and the absorption of chromophores such as melanin and hemoglobin. In addition to fluorescence decay analysis considering the contribution of fluorophores and chromophores, a stable and portable system is desired for clinical measurements and interrogation of biological tissue in vivo. In this study, we have assembled, calibrated, and characterized one of the worlds first portable time-resolved fluorescence spectroscopy system for single-point measurements. This system was designed to be robust and user-friendly for clinical applications. The system was calibrated and characterized in vitro before the clinical application. It was used for evaluation of the photoaging process in sun-exposed and non-exposed skin and for discrimination of clinically similar skin lesions. Significant statistical differences were observed for 10 parameters when comparing normal and photoaged skin (students t-test, p < 0.001), and for all combinations of non-pigmented and pigmented lesions when using tri-exponential decay parameters (Wilcoxon rank sum test, p<0.05). Both in vivo measurements showed promising results and have potential for many applications in dermatology, oncology and aesthetics. Next steps include multivariate data analysis and the determination of the diagnostic resolution of fluorescence lifetime spectroscopy. Further investigation of optical processes related to fluorescence decay changes is necessary, since fluorescence lifetime values in biological tissues reported on the literature are very scarce and heterogeneous and not completely understood. / A análise da espectroscopia e do tempo de vida da fluorescência em tecidos biológicos vem sendo apresentada como uma técnica com grande potencial para a caracterização tecidual com finalidade diagnóstica. Esse potencial é devido às principais vantagens das técnicas ópticas de diagnóstico baseadas em fluorescência, que possibilitam avaliar o metabolismo in situ, sem a necessidade de remoção e processamento da amostra biológica, com uma resposta rápida e não-invasiva. Lesões de pele foram os tecidos investigados no presente estudo. Elas podem ser clinicamente classificadas em dois grandes grupos: pigmentadas e não pigmentadas. Em cada grupo, a discriminação clínica de lesões benignas e malignas pode ser uma tarefa complexa, principalmente para médicos com pouca experiência. Quando essas lesões apresentam características clínicas semelhantes, a escolha do tipo de tratamento torna-se difícil. Nesse contexto, técnicas auxiliares de diagnóstico são de grande relevância para melhorar a resolução de diagnóstico, assim como o planejamento e o sucesso do tratamento. O padrão ouro para o diagnóstico do câncer de pele é obtido por meio da biópsia e posterior análise histopatológica. A obtenção de informações sobre essas características é invasiva e consome bastante tempo. Ao utilizar procedimentos não-invasivos como medidas de tempo de vida de fluorescência, os fluoróforos de mais investigados são o NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo) e o FAD (flavina adenina dinucleotídeo), biomoléculas envolvidas na respiração celular que podem fornecer informação sobre o metabolismo das células. Para diferenciar cada tipo de lesão de pele, é necessário levar em conta a contribuição da emissão de fluoróforos endógenos como o colágeno, elastina e da absorção de cromóforos como melanina e hemoglobina. Além da análise do decaimento de fluorescência considerando a contribuição de fluoróforos e cromóforos, um sistema estável e portátil é desejado para medidas clínicas e investigação de tecidos biológicos in vivo. Nesse estudo, nós montamos, calibramos e caracterizamos um dos primeiros sistemas portáteis do mundo para espectroscopia de fluorescência resolvida no tempo para medidas pontuais. Esse sistema foi projetado para ser robusto e amigável ao usuário em aplicações clínicas. O sistema foi calibrado e caracterizado in vitro antes das aplicações clínicas. Ele foi utilizado para avaliação do processo de fotoenvelhecimento em pele exposta e não-exposta ao sol e para a discriminação de lesões de pele clinicamente semelhantes. Diferenças estatísticas significativas foram observadas para 10 parâmetros na comparação entre pele normal e fotoenvelhecida (teste t-student, p<0.001) e para todas as combinações de lesões pigmentadas e não-pigmentadas ao utilizar parâmetros do decaimento triexponencial (teste Wilcoxon rank sum, p<0.05). Ambas medidas in vivo mostraram resultados promissores e um potencial para muitas aplicações em dermatologia, oncologia e estética. As próximas etapas incluem análise multivariada de dados e determinação da resolução de diagnóstico da espectroscopia de tempo de vida de fluorescência. Uma maior investigação dos processos ópticos relacionados a mudanças nos decaimentos de fluorescência é necessária, pois o número de valores de tempo de vida de fluorescência em tecidos biológicos reportados na literatura é escasso e os valores são heterogêneos e não completamente compreendidos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-21102016-103110 |
| Date | 28 July 2016 |
| Creators | Nogueira, Marcelo Saito |
| Contributors | Kurachi, Cristina |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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